Диссертация (1102290), страница 3
Текст из файла (страница 3)
Показаны пятьсигма-факторов E. coli с указанием генов, которые они регулируют [2].У E. coli существует, по крайней мере, шесть σ-факторов, ассоциирующих скор-ферментом РНК-полимеразы для транскрипции определенных генов (рисунок1.1). Первостепенность того или иного σ-фактора по отношению к остальнымопределяется тем, какой ген транскрибируется в данный момент [2]. Основной σ15фактор E. coli - σ70, он обеспечивает транскрипцию генов, контролирующих иобслуживающихосновныевнутриклеточныепроцессы(геновдомашнегохозяйства) [3,4]. На сегодняшний день собрано много данных о структуре ифункцииσ70-субъединицы[5,6].Полученыструктурынекоторыхфункциональных доменов, отвечающих за связывание с кор-ферментом [5,7,8].Однако до сих пор не были изучены физико-химические свойства белка.
Важноотметить, что σ70-субъединица на текущий момент являетсяне полностьюзакристаллизованным белком. Так, в PDB-банке 3D-структур представлено 23варианта белка.В некоторых работах говорится об образовании агрегатов σ70-субъединицыи ее мутантов, особенно при высокой концентрации белка (свыше 5 мкМ) [9,10] ипри длительном хранении [11].
Кроме этого имеются данные, что нагреваниевыше 49˚C способствует образованию агрегатов шириной 8 нм и длиной 100 нмсогласно данным электронной микроскопии [9]. С тех пор не было полученоникаких результатов по агрегатам σ70-субъединицы.1.2. Агрегация белков. АмилоидБелки являются одним из самых важных классов молекул в живыхорганизмах. Участвуя в различных процессах, они играют ключевую роль вподдержании жизни.
Фолдинг белков представляет собой процесс спонтанногосворачивания полипептидной цепи в уникальную нативную пространственнуюструктуруиявляетсяфундаментальнымиуниверсальнымпримеромсамоорганизации в биологии. Правильное функционирование белков зависит отих самосборки в высокоупорядоченные пространственные вторичные, третичныеи четвертичные структуры. Однако процесс формирования функциональныхзрелых белков по каким-либо причинам может быть нарушен, что приводит кобразованиюбесформенныхлибовысокоупорядоченныхагрегатов[12].Агрегация белков - довольно частое явление, наблюдаемое как in vivo, так и invitro,вразличныхаспектахповседневнойжизни,включаямедицину,16биотехнологии, пищевую промышленность и т.д. Например, в пищевойпромышленности это может быть полезно для создания новых форм загустителей,пенообразователей или эмульгаторов на основе белков; c другой стороны,бесконтрольная и необратимая агрегация белков in vitro может создаватьсерьезные проблемы в биотехнологии и фармации при экспрессии и очисткебелков.
В условии in vivo агрегация белков является необходимой длясвертывания крови и нежелательной в случае образования катаракты. Вчастности,особогобиологическихвниманиямолекулиззаслуживаетнативнойслучайсамоорганизациифункциональнойформыввысокоупорядоченные стабильные структуры на наноуровне, называемыеамилоидными агрегатами.Термин “амилоид” впервые был введен в 1838 году Маттиасом Шлейденомпри описании крахмалистых составляющих растений, а затем долгое времяотождествлялся с веществом, которое красится йодом подобно крахмалу [13,14].Классическимгистопатологическимопределениемамилоидаявляетсявнеклеточное образование с β-складчатой структурой, узнаваемое по зеленомудвулучепреломлению в поляризованном свете при окрашивании Конго красным[14].
Однако в последнее время данное определение находится под вопросом всвязисобнаружениемамилоидныхструктурнепосредственнововнутриклеточном пространстве [15]. Более позднее, биофизическое определениеамилоида включает в себя любые типы полипептидов, образующие β-складки какin vivo, так и in vitro, некоторые из которых могут и не давать характерногодвулучепреломления [16,17].Амилоиды могут вырасти из различных по своим функциям и структуребелков, однако, тем не менее, они имеют много общего. Структурно иморфологически амилоиды объединяет β-складчатая форма (β-цепи, β-тяжи, βлисты), образованная водородными связями в направлении, перпендикулярномдлинной оси фибриллы (рисунок 1.2) [18–20]. При этом, отдельные β-листысвязаны водородными связями вдоль оси фибриллы, формируя так называемуюкросс-β-структуру.17Рисунок 1.2.
3D-структура фибрилл амилоидного β(1-42)-пептида. На диаграммах A, B иC схематично показана межмолекулярная природа взаимодействия отдельных β-тяжей, илицепей (обозначены стрелками). Индивидуальные молекулы выделены разными цветами.ИзображениеDпредставляетсобойкомпьютерноемоделированиефибриллыизпротофиламентов, E – данные криоэлектронной микроскопии единичной фибриллы пептида[20].Также характерными признаками амилоидов являются: специфическоевзаимодействие с Конго красным, которое вызывает красное смещение в спектреадсорбции красителя с 490 нм на 530-540 нм [21,22], специфическое связывание стиофлавином Т, а также нерастворимость в большинстве растворителей (вчастности, в 1%-м додецилсульфате натрия) [23,24].До недавнего времени амилоидную агрегацию связывали только cзаболеваниями человека, такими как нейродегенеративные болезни Альцгеймера,Паркинсона, Хантингтона; диабет второго типа и др.
Однако в последние годыстало ясно, что при определенных условиях амилоидную форму могут иметь чутьлиневсебелки[25].Оказывается,формированиетакназываемых18“функциональных амилоидов” является вполне естественным процессом длянекоторых белков, и этот процесс имеет биологическую значимость. Так,некоторые простейшие с помощью амилоидных отложений прикрепляются кповерхности или объединяются в колонии.
Бактерии Streptomyces coelicolor дляэффективного распространения спор продуцируют воздушные гифы на основеамилоидныхбелковыхфибрилл.Известныпримерыформированияфункциональных амилоидов в клетках млекопитающих из мембранно-связанныхбелков и белков, осуществляющих свою активность при взаимодействии склеточной мембраной [26]. Кроме этого, описаны некоторые склонные кформированию амилоидных фибрилл белки пищевого класса: α- и βлактоглобулин [27–31], овальбумин [32–34], лизоцим [35–37] и др. Исследованиемышечного миоглобина также вывило подобную склонность у белка приопределенных условиях [38].Амилоидныеагрегатыпроявляютустойчивостьквоздействиюденатурирующих агентов и протеаз, имеются данные об их способности ксамосборке и стабильности при высоких температурах (вплоть до 140˚С, рисунок1.3).
Как правило, кипение раствора с белком приводит к разрыву водородных идисульфидных связей, солевых мостиков и дальнейшей необратимой аморфнойагрегации. Однако исследование фолдинга бычьего инсулина, функциональноактивного при комнатной температуре, показало переход белка в состояние сдругой упорядоченной вторичной структурой при повышенной температуре [39].Что является толчком и движущей силой к образованию столь уникальныхамилоидныхагрегатов?Надэтимвопросомсегодняработаютдесяткилабораторий мира.
Имеются данные, что амилоидогенные белки типа инсулинапод воздействием окружающей среды образуют частично упорядоченныеинтермедиаты,которыесоединяютсявместегидрофобнымииэлектростатическими взаимодействиями. Получаемое таким образом ядро служитстартовой точкой роста амилоида [39].Свойство биологических молекул спонтанно самоорганизовываться ввысокоупорядоченныестабильныеструктурынананоуровнеделаетих19привлекательными объектами в качестве матрицы для других материалов, необладающих таким свойством (например, металлов). Если амилоидные фибриллыобработатьснаружиметаллом,томожноизготовитьэлектрическуюнанопроволоку [40].
Подобные “нанодевайсы” уже были получены с нанесениемна такие фибриллы наночастиц золота [41] и открывают новые горизонтыисследований в области бионаноэлектроники. В работе [40] описаны различныебиоинженерные направления использования амилоидов.Рисунок1.3.АСМ-изображенияамилоидныхфибриллинсулинаприразныхтемпературах [39].20Так, в качестве перспективного применения амилоидов предлагаетсясоздание наноструктурированных пленок с прочностью, сравнимой с прочностьюшелка (рисунок 1.4, 1.5).
В сфере создания макроскопических форм углеродныхнаноматериалов пока остается проблема установления прочных контактов междусоседними нанотрубками, в то время как белковые нанофибриллы богатыфункциональными группами, которые обеспечивают структурную связь за счетВан-дер-Ваальсовых и гидрофобных взаимодействий [42].Мономеры белкаФибриллыНаноструктурированныебелковые пленкиРисунок 1.4. Собранные в амилоидные фибриллы белковые молекулы упакованы вфункциональную пленку [42].Рисунок 1.5. Сравнительная диаграмма модуля Юнга различных материалов [42].21Другое применение амилоидов было продемонстрировано в областиорганической фотовольтаики. Отличие органических полупроводников отнеорганических заключается в образовании связанных пар - экситонов вместовозбуждения непосредственно носителей заряда при поглощении света.
Однако вконцепции двухслойной батареи экситоны, движущиеся по полупроводникупосле поглощения света, способны сместиться на расстояния лишь порядкананометров. Поэтому сегодня ученые перешли к концепции объемногогетероперехода, где вместо двух слоев используются взаимопроникающие сеткидонора и акцептора. С использованием амилоидных фибрилл в качествеориентирующей матрицы для полимерных доноров и акцепторов былипродемонстрированы улучшенные характеристики органических солнечныхэлементов [43]. Самоорганизация белков может также служить движущей силойдля сборки других связанных с ними молекул.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
