Диссертация (1102290), страница 2
Текст из файла (страница 2)
сoli на её агрегацию.4) Впервые предложенная модель агрегации σ70-субъединицы РНКполимеразы E. сoli позволяет объяснить полиморфизм образуемыхбелком агрегатов.Методы исследованияЦентральным методом исследования в работе является атомно-силоваямикроскопия.Дополнительноприменялисьнезависимыеметоды:просвечивающая электронная микроскопия, деполяризованное динамическоерассеяние света, электрофорез, спектрометрия, молекулярная динамика.Научная и практическая значимость работы8Амилоиднаяагрегацияσ70-субъединицыРНК-полимеразыE.coli,обнаруженная в бактериальной системе, расширяет класс амилоидогенныхбелков.Определение пространственной структуры амилоидных агрегатов σ70субъединицы и анализ влияния солевого окружения на фибриллообразованиепозволит выявить некоторые общие закономерности формирования амилоидныхструктур разных типов белков и их уровней организации и приблизиться кпониманию регуляции этого процесса.
Кроме того, агрегация σ70-субъединицыможет быть связана с регуляцией транскрипции в клетке. Наконец, возможностьсоздания амилоидных фибрилл in vitro на основе нетоксичных белковвостребована для большого спектра технологических приложений. В частности,благодаря особым физико-химическим свойствам, амилоидные фибриллы σ70субъединицы могут быть использованы для создания молекулярных архитектур вмолекулярной электронике и других нанобиотехнологических приложениях.Положения, выносимые на защиту1) σ70-субъединица РНК-полимеразы E. coli способна к спонтанномуобразованию in vitro, в том числе, при условиях, близких кфизиологическим,двухвидовагрегатов:амилоидоподобныхпалочкообразных агрегатов и червеобразных структур.2) Электростатические взаимодействия играют важную роль в агрегацииσ70-субъединицы.3) РазупорядоченныеучасткиN-концевогодоменаσ70-субъединицыпрепятствуют интенсивной агрегации белка; использование мутантноговарианта белка, частично или полностью лишённого этого участка,позволяет значительно улучшить формирование амилоидных агрегатов.4) С помощью предложенной модели “кофейных чашек” можно объяснитьполиморфизм и пути формирования того или иного типа наблюдаемыхагрегатов белка.9Достоверность изложенного в диссертации материала обеспечиваетсяиспользованием широко апробированных подходов и методов.
Результатынаходятся в соответствии с данными, полученными ранее другими авторами.Личный вклад диссертантаАвтор лично проводил анализ литературных данных, участвовал впостановке задач исследования, планировании и проведении экспериментов,получении результатов и выводов, подготовке публикаций и докладов на научныхконференциях по теме диссертационной работы.Участие автора в исследовании: ПодготовкаобразцовдляАСМ-сканирования,получениеАСМ-изображений, их обработка и анализ были проведены автором лично. Данные просвечивающей электронной микроскопии были полученысовместно с Абрамчуком Сергеем Савельевичем, а также КорнеевымДенисом Владимировичем. Анализ данных деполяризованного динамического рассеяния светапроводился совместно с Лаптинской Татьяной Васильевной.Апробация работыМатериалыисследованияопубликованыврецензируемыхнаучныхизданиях, индексируемых в базах данных Web of Science, Scopus, RSCI (3 статьи)и в сборниках тезисов докладов и конференций (9 публикаций):Статьи по теме диссертации:1.
E.V. Dubrovin, O.N. Koroleva, Yu.A. Khodak, N.V. Kuzmina, I.V.Yaminsky, V.L. Drutsa. AFM study of Escherichia coli RNA polymerase σ70subunit aggregation // Nanomedicine: Nanotechnology,Biology andMedicine, - 2012, - Vol. 8, - P. 54-62.2. O.N. Koroleva, E.V. Dubrovin, Yu.A. Khodak, N.V. Kuzmina, I.V.Yaminsky.
The model of amyloid aggregation of Escherichia coli RNA10polymerase σ70 subunit based on AFM data in vitro assays // CellBiochemistry and Biophysics, - 2013, - Vol. 66, - P. 623-36.3. O. N. Koroleva, E. V. Dubrovin, A. P. Tolstova, N. V. Kuzmina, V.Laptinskaya, I. V. Yaminsky and V. L. Drutsa. A hypothetical hierarchicalmechanism of the selfassembly of the Escherichia coli RNA polymerase σ70subunit // Soft Matter, - 2016, - Vol.
12, - P. 1974-1982.Публикации в сборниках тезисов докладов конференций:1. Dubrovin E., Koroleva O., Khodak Y., Kuzmina N., Yaminsky I., Drutsa V.Amyloid-like aggregation of RNA polymerase σ70 subunit: an AFM study //European Biophysical Journal with Biophysics Letters, - 2013, - Vol. 42, - P.S100.2. Н.В.Кузьмина.Изучениеагрегациисигма-субъединицыРНК-полимеразы с помощью АСМ // Тезисы Международной научнойконференции студентов, аспирантов и молодых ученых "Ломоносов2011", Москва, МГУ имени М.В.Ломоносова, 11-15 апреля 2011, секция"Физика", стр. 9-10.3.
Е.В.Дубровин,О.Н.Королева,Ю.А.Ходак,Н.В.Кузьмина,И.В.Яминский, В.Л.Друца. Исследование палочкообразной агрегациисигма70-субъединицы РНК-полимеразы Escherichia coli методом АСМ //Тезисы 17-го международного конгресса биофизиков, Пекин, Китай,30.10-03.11.2011, стр. 499-500.4. Н.В.Кузьмина, Е.В.Дубровин. Механизмы и особенности агрегациисигма-субъединицы РНК-полимеразы Е.соli // Тезисы Ломоносовскихчтений, МГУ имени М.В.Ломоносова, 14-18 апреля 2014, секция"Физика", стр.
53-54.5. Н.В.Кузьмина,Е.В.Дубровин,О.Н.Королева,Ю.А.Ходак,И.В.Яминский, В.Л.Друца. Применение атомно-силовой микроскопии висследовании агрегации сигма70-субъединицы РНК-полимеразы E.coli //11Тезисы 7-й международной конференции "Современные достижениябионаноскопии". МГУ имени М.В.Ломоносова, 17-19 июня 2014, стр. 12.6. Дубровин Е.В., Королёва О.Н., Ходак Ю.А., Друца В.Л., Кузьмина Н.В.,ЯминскийИ.В.амилоидныхАСМ-исследованиеагрегатовструктурыпалочкообразныхсигма(70)-субъединицыРНК-полимеразыEscherichia coli // Сборник материалов Российско-АмериканскогоСимпозиума по биотехнологии в промышленности, сельском хозяйстве издравоохранении, место издания ФГБНУ НИИ РИНКЦЭ Москва, 13-14марта 2014, Филадельфия, стр.
75-76.7. Dubrovin E.V., Koroleva O.N., Khodak Y.A., Kuzmina N.V., Yaminsky I.V.,Drutsa V.L. Atomic force microscopy investigation of amyloid fibrilformation of Escherichia coli RNA polymerase σ(70) subunit // Сборниктезисов 18-го Международного Конгресса по Микроскопии, 7-12сентября 2014, Прага, стр. 1569-1570.8. Кузьмина Н.В., Дубровин Е.В. Амилоидные нанофибриллы σ70субъединицы РНК-полимеразы E. сoli // Сборник тезисов докладов 3-йВсероссийскойнаучноймолодежнойконференции“Актуальныепроблемы и нано- и микроэлектроники”, 1-4 декабря 2015, Уфа, стр. 89.9. Н.В.Кузьмина, Е.В.Дубровин. Механизм формирования и тонкаяструктура амилоидных нанофибрилл σ70-субъединицы РНК-полимеразыE.coli // Сборник тезисов восьмой международной конференции“Современные достижения бионаноскопии”, 15 июня 2016, Москва, стр.16.Основные результаты работы доложены на следующих конференциях:Международная научная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых"Ломоносов-2011",Москва,11-15апреля2011;17-ймеждународныйбиофизический конгресс, Пекин, 30.10-03.11.2011; Ломоносовские чтения,Москва, 14-18 апреля 2014; 7-я международная конференция "Современныедостижения бионаноскопии", Москва, 17-19 июня 2014; 18-й Международный12конгресспомикроскопии,Прага, 7-12сентября2014;Международнаяконференция “Super resolution in different dimensions”, Москва, 2-3 июня 2015;Всероссийская научная молодежная конференция “Актуальные проблемы и нанои микроэлектроники”, Уфа, 1-4 декабря 2015; Восьмая международнаяконференция “Современные достижения бионаноскопии”, Москва, 15 июня 2016.Объём и структура диссертацииДиссертация состоит из введения, 4 глав, результатов и выводов, спискасокращений и списка цитируемой литературы.
Работа изложена на 110 страницах,содержит 48 рисунков и 2 таблицы.Работа поддержана следующими грантами: ГрантРФФИ15-32-20629“Атомно-силоваямикроскопияконвергентных транскрипционных комплексов” Грант РФФИ 13-04-01504 “Исследование механизмов образованияамилоидных нанофибрилл с использованием бактериальных систем” Грант Президента Российской Федерации для государственнойподдержки молодых российских ученых - кандидатов наук МК312.2013.2"Развитиефизико-биологическихподходовдлямоделирования биологических процессов с применением атомносиловой микроскопии"13Глава 1. Литературный обзор1.1. РНК-полимераза. σ-субъединицаОдним из фундаментальных геномных процессов, лежащих в основежизнедеятельности организмов, является транскрипция - синтез РНК на матрицеДНК. Этот процесс катализируется ферментом РНК-полимеразой и регулируетсяцелым комплексомеевзаимодействийсДНК, белкамиилигандами.Транскрипция эукариот протекает с участием трех разных РНК-полимераз,(состоящих из большого количества субъединиц), каждая из которых дляприсоединения к промоторам использует специфичные факторы транскрипции(TFI, TFII и TFIII).
Активация промотора происходит с помощью большого белка-TATA-фактора, называемогопоследовательностьютак из-за соединениянуклеотидовпромотора-со специфическойTATAAA-(TATA-бокс).Присоединение ТАТА-фактора облегчает взаимодействие промотора с РНКполимеразой эукариот.РНК-полимераза прокариот состоит из пяти различных белков: двух α, β, β'и ω-субъединиц. В таком составе она называется кор-ферментом. РНКполимераза транскрибирует гены, начиная с определенного участка ДНК промотора [1]. Чтобы началась транскрипция, с кор-ферментом долженассоциировать еще один важный белок - так называемый сигма-фактор, илисигма-субъединица (σ-субъединица). Именно он отвечает за инициациютранскрипции. У σ-фактора имеется два домена для связывания: один - с корферментом и другой - с промотором.
В состоянии, когда кор-фермент связан с σсубъединицей, РНК-полимераза называется холоферментом. Находясь в составехолофермента,σ-субъединицапринимаетрастянутуюконформацию,чтоприводит к увеличению сродства к промотору и взаимодействию с ним. Послеузнавания промотора, происходит синтез олигонуклеотида из 8-10 нуклеотидныхостатков, затем σ-фактор диссоциирует от кор-фермента, и в дальнейшем синтезматричной РНК осуществляется полностью кор-ферментом [1]. Транскрипциягенов регулируется путем модификации кор-фермента, взаимодействием с14регуляторными белками или изменением регуляторных участков генов.
Втранскрипции генов участвуют различные σ-факторы (Рисунок 1.1).Гены домашнегохозяйстваАзот-регулируемыегеныГены белка тепловогошокаГены белкахемотаксиса флагеллГены белка экстремальноготемпературного шокаГены белка ионноготранспортаРисунок 1.1. Прокариотическая РНК-полимераза (кор-фермент) распознает промотор.Растянутая конформация сигма-фактора позволяет ей связаться с промотором.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
