Разработка способа получения гибридной лактазы с помощью рекомбинантного штамма-продуцента (1094961)
Текст из файла
На правах рукописиГришин Дмитрий ВикторовичРазработка способа получения гибридной лактазы с помощьюрекомбинантного штамма-продуцентаСпециальность: 03.00.23 – «Биотехнология»АВТОРЕФЕРАТдиссертации на соискание ученой степеникандидата биологических наукМосква-2009 Работа выполнена в Московском государственном университете инженернойэкологии (МГУИЭ) Федерального агентства по образованию РФ, на кафедре«Экологическая и промышленная биотехнология».Научный руководитель:- Никитин Александр Викторович,доктор медицинских наук, профессорОфициальные оппоненты:- Миронов Александр Сергеевич,доктор биологических наук, профессор-Бибикова Маргарита Васильевна,доктор биологических наук, профессорВедущая организация:Государственное научное учреждение«Всероссийский научно-исследовательскийинститут пищевой биотехнологии РАСХН»Защита состоится «___» _______2009 г.
в_____часов на заседании объединённогодиссертационного совета ДМ 212.204.13 в Российском химико-технологическомуниверситете им.Д.И.Менделеева по адресу: 125047, Москва, Миусская пл., д.9,ауд. 443.С диссертацией можно ознакомиться в информационно-библиотечном центреРХТУ им. Д.И. Менделеева.Автореферат разослан «___» ____________2009г.Учёный секретарь диссертационного советаДМ 212.204.13кандидат технических наукШакир И.В. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫАктуальность работы. Фермент лактаза (β-галактозидаза), расщепляющийлактозу молока имеет особое значение в раннем детстве, так какдисахаридлактоза, содержащийся в молоке является основным источником галактозы,которая участвует в синтезе галактоцереброзидов, необходимых для нормальногоразвития ЦНС и сетчатки глаза. Уменьшение количества лактозы и производных еёгидролиза может послужить развитию синдрома мальабсорбции (СМА), которыйвыражается, в частности, в недостаточности лактазы и в сопряжённом с этимсостоянием лактозонепереносимости [Ладодо К.С., 2000].
Наиболее эффективнымспособом профилактики и лечения СМА, являетсяпромышленное созданиебезлактозных продуктов, либо приём ферментных препаратов (мезофильная βгалактозидаза), расщепляющих лактозу.Получение безлактозных молочных продуктов до сих пор остаётсядостаточно трудоёмким процессом, базирующимся на длительном осаждениибелка обезжиренного молока, растворении осажденного белка в щелочи илирастворах щелочных солей и последующей распылительной сушке, после которойэкстракцией специально подобранными растворителями удаляют собственнолактозу.Получение ферментных препаратов для гидролиза β-галактозидов такжесводится к трудоёмкой химической очистке фермента, приводящей к егоинактивации.
Кроме того для использования в пищевой промышленности имедицинеферментдолженнормироватьсяпосодержаниюрядавеществ,используемых для иммобилизации и элюции. Также, использование мезофильныхферментов, ограничено в тех случаях, когда производственный процесснеобходимо проводить при повышенной температуре (выше 60оС).Принципиально новым подходом к получению препаратов β-галактозидазс улучшеннымихарактеристикамиявляетсяназываемыйfusion – технологией иликонструкций,когдаводнойрамкебиотехнологический приём,технологией слитных (химерных)трансляцииобъединяютсягенныепоследовательности разных белков [Miller, R.
C., Kilburn, D. G. et al., 1989; Gurvits, I. D., Velikodvorskaya G. А. et al., 2007]. Использование подобной технологиипозволило создать фермент, обладающий улучшенными свойствами: повышеннойтермостабильностью и способностью к самостоятельному аффинному связываниюс биологически совместимыми субстратами, такими как декстран [Cavataio F. etal., 2005].Положения,конструкциявыносимыеДСД-сп-β-ГАЛназащиту.содержащая1.Рекомбинантнаядекстрансвязывающийбелковаядоменикаталитическую последовательность фермента термостабильной β-галактозидазы иеё штамм-продуцент. 2. Разработка методов очистки рекомбинантных белков,основанная на сочетании использования термостабильности целевого продукта иегодекстрансвязывающихсвойств.3.Созданныйплазмидныйвекторсрегуляторными областями и геном химерного белка ДСД-сп-β-ГАЛ.
4. Декстранбелковый комплекс на основе белка ДСД-сп-β-ГАЛ и декстранового сорбента длягидролиза бета-галактазидов.Цель и задачи исследования. Целью данной работы являлось созданиегибридной (химерной) рекомбинантной белковой конструкции ДСД-сп-β-ГАЛ,имеющей декстрансвязывающий домен и активность термостабильной бетагалактозидазы, её штамма-продуцента и исследование физико-химических свойствданного белка.В соответствии с поставленной целью в процессе работы предстояло решитьследующие основные задачи:1. Получение мутантного гена ДСД из Leuconostoc mesenteroides со спейсеромна С-конце.2. Создание генной последовательности химерного белка ДСД-сп-β-ГАЛ.с геном ДСД и геном термостабильной β - галактозидазы изThermoanaerobacter ethanolicus, объединёнными через спейсер.3.
Создание бактериального штамма-продуцента обеспечивающегоэффективную экспрессию химерного рекомбинантного белка ДСД-сп-βГАЛ. 4. Изучение физико-химических свойств белковой конструкции ДСД-сп-βГАЛ.5. Изучение ферментативной активности белка ДСД-сп-β-ГАЛ.6. Оптимизация условий получения комплекса декстрана и белка ДСД-сп-βГАЛ. для гидролиза бета-галактозидов.Научная новизна.На базе концепциислитных генно-инженерныхконструкций впервые был спланирован и сконструирован рекомбинантныйплазмидныйбиосинтезвекторpGD-10,гибридногобелкапозволяющийосуществлятьДСД-сп-β-ГАЛ,индуцированныйобладающегоодновременнодекстрансвязывающими свойствами и активностью фермента термостабильной βгалактозидазы.Впервые были получены бактериальные продуценты конструкции ДСД-сп-βГАЛ E.coli[pGD-10], обеспечивающие экспрессию целевого белка на уровне 10%от тотального белка клеток.Впервые была предложена высокоэффективная схема выделения, очистки ииммобилизации рекомбинантного белка ДСД-сп-β-ГАЛ на декстрановом сорбенте,основаннаянауникальныхсвойствахдекстрансвязывающегодоменаипозволяющая получать препараты белков со степенью чистоты более 90%.Практическое значение работы.
Разработанная схема получения штаммапродуцента химерного белка ДСД-сп-β-ГАЛ, а также способ очистки ииммобилизации данного белка на декстрановых сорбентах могут найти применениев медицине, в качестве компонентной базы при создании комплексных препаратовдля профилактики синдрома мальабсорбции.
Также комплекс данной белковойконструкции с декстраном может быть использован в пищевой промышленностипри реализации схем получения безлактозных продуктов.Апробация работы. Апробация диссертации состоялась 14 октября 2009г.на заседании кафедры ЭиПБ МГУИЭ. Основные результаты исследований былипредставлены на XII Всероссийской молодежной школы-конференции поактуальным проблемам химии и биологии, МЭС ТИБОХ, Владивосток, 7–14сентября 2009, С 17., на VI Молодёжной науч. конф. «Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии», Москва, 5 апреля 2006 г. Поматериалам диссертации опубликовано 5 печатных работ, отражающих основноесодержание работы.Структура и объёмсодержит 28 рисунков иработы.
Диссертация изложена на 125 страницах;5 таблиц; состоит из введения, обзора литературы,экспериментальной части, результатов и их обсуждений, выводов, спискацитируемой литературы, включающего 110 наименований и приложений.РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ1. Создание бактериальных штаммов продуцентов белка ДСД-сп- β-ГАЛ1.1. Создание бактериального штамма-продуцента, обеспечивающегоклонирование гена и экспрессию белка LacZThEhОдним из наиболее значимых ферментов в группе гликозилгидролазявляется термостабильная β - галактозидаза из Thermoanaerobacter ethanolicus,кодируемая геном LacZThEh (β-ГАЛ).
Данный фермент способен продолжительнодействовать при высоких температурах (65-80оС) и в широком диапазоне рН 5,0-7,5[Volkov I. Yu. et al., 2005]. Поэтому ген этого белка был выбран в качестве одногоиз объектов наших исследований. Биоинформационные последовательности β галактозидазы аннотированы в банке данных UniProt под номером Y08557. Т.к.плазмидаpQELacZThEh(pR624,любезнопредоставленасотрудниками.лаборатории МДиГК ВНИИСБ Сергиенко О.В. и Анисимовой С.В.) с геном β галактозидазы Thermoanaerobacter ethanolicus ранее уже была получена на базекоммерческого вектора серии pQE, то нашей задачей, на данном этапе, явилосьсоздание продуцента способного обеспечить эффективность клонирования иэкспрессии гена данного белка в клетках E.
coli.Плазмида pQELacZThEh была трансформирована в клетки E. coli DH5αметодом электропорации. Была изучена экспрессия генов белка β - галактозидазыштамма E. coli DH5α (pQELacZThEh), что являлось одним из важнейших условийпредстоящей генно-инженерной работы. Индукция экспрессии гена проводиласьпо стандартному протоколу фирмы Quagene. Однако изучение экспрессии спомощью электрофореза в 12% ПААГ по Лэммли показало отсутствие белковых полос ожидаемого молекулярного веса. На основе анализа данных литературы, былсделан вывод о том, что эффективность гетерологичной экспрессии гена белкаLacZThEh в E.
coli оказалась более успешной при включении в состав среды LB, навремя индукции 10мМ СаCl2, 10mM MnCl2, увеличении доли индуктора ИПТГ с 0,1до 0,5 мМ, а также при изменении времени индукции с 3 ч (при 37оС) до 15 ч (прикомнатной температуре). В результате проделанной работы, нам удалось получитьэффективный продуцент позволяющий выделить в препаративных количествахметодом щелочного лизиса плазмидную ДНК, с геном термостабильной β галактозидазы, а также обеспечивающий экспрессию белка LacZThEh (β-ГАЛ) науровне 10 -15% от тотального белка штамма.1.2. Создание бактериального штамма-продуцента, обеспечивающегоэкспрессию белка DBD(Gly-Ser)51.2.1. Получение и клонирование гена ДСД из Leuconostoc mesenteroidesДСД (DBD – dextran binding domain) или декстрансвязывающий доменотносится к группе карбогидратсвязывающих модулей (КСМ) это часть комплексагидролитических внеклеточных ферментов ряда бактерий.
В данном случае особыйинтерес представляет каталитический домен декстрансахаразыиз Leuconostocmesenteroides. Этот белковый домен интересен своей способностью специфическисвязываться с различными формами декстрана. Известно, что бактерии родаLeuconostoc(Leuconostoclactis,LeuconostocdextranicumиLeuconostocmesenteroides) используются в пищевой промышленности в качестве заквасочныхкультур при производстве молочнокислых продуктов и квашеной капусты, поэтомув качестве источников микроорганизмов рода Leuconostoc могут служитьразличные пищевые продукты молочнокислого брожения.Образцы квашеной капусты и простокваши суспендировались в жидкойселективной питательной среде (сахароза 100г/л; дрожжевой экстракт 2,5 г/л;K2HPO4 5 г/л; (NH4)2SO4 0,2 г/л; MgSO4x7H2O 0,2 г/л; NaCl 1,0 г/л.) в которуюзасевались порции соответствующего образца.
Характеристики
Тип файла PDF
PDF-формат наиболее широко используется для просмотра любого типа файлов на любом устройстве. В него можно сохранить документ, таблицы, презентацию, текст, чертежи, вычисления, графики и всё остальное, что можно показать на экране любого устройства. Именно его лучше всего использовать для печати.
Например, если Вам нужно распечатать чертёж из автокада, Вы сохраните чертёж на флешку, но будет ли автокад в пункте печати? А если будет, то нужная версия с нужными библиотеками? Именно для этого и нужен формат PDF - в нём точно будет показано верно вне зависимости от того, в какой программе создали PDF-файл и есть ли нужная программа для его просмотра.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
