Разработка способа получения гибридной лактазы с помощью рекомбинантного штамма-продуцента (1094961), страница 2
Текст из файла (страница 2)
Далее, после 18 ч. инкубации (26оС,150 об/мин), аликвоты из выращиваемого объёма переносились на 2%агаризованную питательную среду того же состава и инкубировались в течение 48ч. при 26оС [Dimic G. R., 2006]. Целевые колонии, образованные бактериями рода Leuconostoc имели вид слизистых опалесцирующих капель. После скрининга,изолированные клоны выращивались вжидкой селективной среде, дляпоследующего выделения хромосомной ДНК методом. Ген декстрансвязывающегодомена был получен благодаря ПЦР, с помощью прямого и обратного праймеров(искусственно введённые сайты рестриктаз подчёркнуты), фланкирующих геннуюпоследовательность ДСД, при этом в качестве ДНК матрицы использоваласьхромосомная ДНК Leuconostoc mesenteroides, выделенная методом фенолхлороформнойэкстракции.Вработеиспользовалисьолигонуклеотиды,синтезированные в ЗАО «Синтол» и ЗАО «Евроген»:GBD11F CCACCGCCATGGATGGGATCCACAAATCAGTATTATCAATTAGCAGATGGTAAANcoIBamHIRevGBD AGACTAAGATCTGGCTGACACAGCATTTCCATTATTATCAAABglIIДля клонирования продукт амплификации встраивался в коммерческийвектор pQE6 (Quageen, USA), методом лигирования полученных рестрикционныхфрагментов по сайтам рестрикции NcoI, BglII/BamHI.
Затем полученнаяплазмидная ДНК (pQEDBD) (Рис. 1.) выделялась из трансформантов методомщелочного лизиса, после чего нуклеотидная последовательность целевого генабыла подтверждена с помощью рестрикционного анализа и секвенирования наавтоматическом секвенаторе.Promoter SDMat. PeptideTerminatorРис. 1. - Организация генно-инженерной конструкции с геном ДСД (DBD) в плазмидеpQEDBD. 1.2.2. Получение экспрессионной плазмиды pQEDBDsp с геном ДСД изLeuconostoc mesenteroides со спейсером на С-конце.1.2.2.1.
Получение гена ДСД из Leuconostoc mesenteroides со спейсером на Сконце и создание экспрессионных векторов, содержащих ген белка DBD(GlySer)5.Декстрансвязывающий домен, используемый в наших исследованиях долженбыть пространственно удалён от бета-галактозидазы, что требует наличия рядаотличий от ДСД, аннотированного во Всемирном генбанке.
Прежде всего, отличиезаключаетсявнеобходимостиприсутствиянаС-концеаминокислотнойпоследовательности белка глицин-серинового спейсера (Gly-Ser)5, которыйнеобходим для пространственного разделения различных функциональныхдоменов. Создание гена DBD(Gly-Ser)5 или иначе ДСД-сп, кодирующего белокДСД и глицин-сериновый спейсер (сп), осуществлялось в два этапа методом«праймеропосредованнойнаращиваниепрогулки»,С-концевойприспейсернойэтомпроисходилопоследовательностидляпостепенноечегобылиспланированы следующие корректирующие праймеры:GBD11F CCACCGCCATGGATGGGATCCACAAATCAGTATTATCAATTAGCAGATGGTAAANcoIBamHIRevDBD-1: 5’-GGAGCCAGAACCCGGGGATCTTGCTGACAC-3’RevDBD-2: 5’-AACTAAGCTTAGATCTGGCGCCAGAACCGGAACCAGAGCCGGAGCCAGAACC-3’HindIII BglIIНа первом этапе «праймеропосредованной прогулки» использовалисьпраймеры GBD11F и RevDBD-1, на втором - GBD11F и RevDBD-2, последнийспланирован внахлёст с RevDBD-1. В качестве матрицы для проведения ПЦРиспользовали плазмидную ДНК pQEDBD в концентрации 0,3 мг/мл.Promoter SDMat.
PeptideSpacer TerminatorРис. 2. - Организация генно-инженерной конструкции pQEDBDsp. Далее, по сайтам рестрикции NcoI и HindIII скорректированный ген ДСД, былинтегрирован в бактериальный вектор pQE6 (Quageen, USA), в процессе чего быласконструирована экспрессионная плазмида pQEDBDsp(Рис.
2.). В результатеманипуляций был получен плазмидный вектор содержащий скорректированныйген ДСД с С-концевым спейсером.Идентичность клонированного в составе вектораpQEDBDsp гена ДСД-сп (размер гена ≈ 500 п.н.) была подтверждена с помощьюПЦР (рис. 3), посредством использовавшихся ранее прямого (GBD11F) и обратногопраймеров (Revgal), при тех же параметрах ПЦР. Рис.
3. - Электрофорез ПЦР продуктов в 1%агарозном геле.1.Отрицательный контроль (MQ, Taq полимераза 5ед.ак); 2.Отрицательный контроль (pQE6, Taqполимераза 5ед.ак); 3. ПЦР продукт гена белка ДСДсп, проба №1 (500 п.н.); 4. ПЦР продукт гена белкаДСД-сп, проба №2 (500 п.н.); 5. ПЦР продукт генабелка ДСД-сп, проба №3 (500 п.н.); 6. ПЦР продуктгена белка ДСД-сп, проба №4 (500 п.н.); 7.
ПЦРпродукт гена белка ДСД-сп, проба №5 (500 п.н.); 8.Маркер мол. веса (100 b.p.).1.2.3. Создание бактериальных продуцентов белка DBD(Gly-Ser)5.Плазмида pQEDBD(Gly-Ser)5 (или pQEDBDsp) была трансформирована вклетки E. coli DH5aметодом электропорации. Была проверена возможнаяэкспрессия генов химерного белка в штамме E. coli DH5a. с помощью ИПТГ.Анализ экспрессии на основании электрофореза в 17% ПААГ по Лэммли показалприсутствие белковых полос ожидаемого молекулярного веса 16 кДа с уровенемэкспрессии 25-30% от тотального белка клетки (Рис.
4.). Рис. 4. - Анализ экспрессии белкa ДСД-сп в клеткахE. coli DH5a. (электрофорез в 12% ПААГ по Леммли).1) Маркер молекулярного веса, лизоцим 14 кДа, 2) E.coli DH5a. [pQEDBDsp], образец№1, индукция - 16,0 кДа,3) E. coli DH5a. [pQEDBDsp], образец№2, индукция - 16,0кДа, 4) E. coli DH5a. [pQEDBDsp] , образец№1, доиндукции, 5) E. coli DH5a [pQEDBDsp], образец№2, доиндукции. 1.3. Создание бактериального штамма-продуцента обеспечивающегоэкспрессию химерного белка ДСД-сп-β-ГАЛ в цитоплазме клеток E. coli.1.
3. 1. Создание экспрессионных векторов, содержащих ген белка ДСД-сп-βГАЛ.Для создания экспрессионной плазмиды pQEDBDspLacZThEh (далее pGD10)с геном целевого химерного белка ДСД-сп-β-ГАЛ было осуществлено лигированиеплазмиднойконструкцииpQELacZThEhсгидролизованнойгеномтермостабильнойбета-галактозидазыэндонуклеазами рестрикцииBamHI/BglIиплазмидного вектора с геном ДСД со спейсером pQEDBDsp, гидролизованнойрестриктазамиBglII/BglI. Процессы дальнейшего лигирования, молекулярногосубклонирования в E.coli DH5a и выделения плазмидной ДНК проводились постандартным методикам [Маниатис Т. и др., 1984].Идентичность клонированного в составе вектора pGD-10 гена ДСД-сп-βГАЛ размером 2683 п.н.
была подтверждена с помощью рестрикционногоскрининга,секвенированиянаавтоматическомсеквенатореMegaBace1000(Amersham Bioscience corp., CША) (ЗАО Евроген), а также посредствомполимеразно-цепной реакции, в присутствии прямого (GBD11F) и обратногопраймеров (Revgal):GBD11F 5’ CCACCGCCATGGATGGGATCCACAAATCAGTATTATCAATTAGCAGATGGTAAA 3’Revgal: 5’ GAGAAGACGAAAGGGCCTATAACGCCTATTTTTATAGGTTAAAATG 3’ Рис. 5. - Электрофорез ПЦР продуктов в1% агарозном геле.1. ПЦР продукт гена белка ДСД-сп-βГАЛ, проба №1 (2683 п.н.); 2.Отрицательный контроль (pQE6, Taqполимераза); 3. ПЦР продукт гена белкаДСД-сп-β-ГАЛ, проба №2 (2683 п.н.); 4.Отрицательный контроль (pQE6, Taqполимераза); 5.
ПЦР продукт гена белкаДСД-сп-β-ГАЛ, проба №3 (2683 п.н.); 6.Отрицательный контроль (pQE6, Taqполимераза); 7. Маркер мол. веса (фаглямбда EcoRI/HindIII). Параметры амплификации: 95оС – 5 мин; (94оС – 20с, 67 оС - 30с, 72оС –2,5мин.)x30; 72оС – 5мин; 10оС – хранение. Режим амплификации – точный.Продукты амплификации детектировались в 1% агарозном геле (Рис.5). Такимобразом была получена экспрессионная конструкция с геном целевого химерногобелка (Рис. 6.).PromoterSDDBDSpacerLacZThEhTerminatorРис. 6.
- Организация генно-инженерной конструкции pGD10.1.3.2. Создание бактериальных продуцентов гена белка ДСД-сп-β-ГАЛ.Плазмида pGD10 была трансформирована в клетки E. coli DH5a методомэлектропорации. Была проверена возможная экспрессия генов химерного белкаДСД-сп-β-ГАЛ с помощью ИПТГ. Анализ экспрессии посредством электрофорезав 12% ПААГ по Лэммли показал присутствие белковых полос ожидаемогомолекулярного веса 102,3 кДа, однако, при этом уровень экспрессии былдостаточно низок (менее 5% от тотального белка штамма). Известно, что уровеньэкспрессии многих белков варьирует в различных штаммах E. coli.
Также времяиндукции влияет на количество продуцируемого белка. Очевидно, что проверкавозможного повышение уровня экспрессии белка ДСД-сп-β-ГАЛ с помощьюданных подходов просто необходима в рамках данной работы.1.3.3. Оптимизация условий экспрессии белка ДСД-сп-β-ГАЛ1.3.3.1. Оптимизация времени индукции.Для оптимизации индукции целевого белка в клетках штамма продуцента мыварьировали время индукции (с 2 часов при 37 оС до 15 часов при комнатнойтемпературе).
В результате проведенных экспериментов оказалось, что увеличениевремени индукции до 15 ч вызывает повышение уровня экспрессии (Рис.7.).Очевидно, что изменение времени индукции является одним из решающихфакторов влияющим на уровень экспрессии целевого белка. 1.3.3.2. Оптимизация количества индуктора.По данным литературы известно, что хромосомная ДНК клеток Th.Ethanolicus и L. mesenteroides имеет много сходного с клетками E. coli, поколичеству GC пар азотистых оснований. Для клеток E.
coli характерным являетсяналичие примерно 60% GC.Рис. 7. - Электрофорез в 10% ПААГ вприсутствии SDS.1. Штамм DH5a – до индукции, 2. ШтаммDH5a [pGD10] – до индукции, 3. ШтаммDH5a – индукция,4. Штамм DH5a [pGD10] – индукция, 5.Штамм DH5a до индукции; термолиз (75оС,45 мин), 6. Штамм DH5a [pGD10] – доиндукции; термолиз (75оС, 45 мин), 7.Штамм DH5a [pGD10] – индукция;термолиз (75оС, 45 мин), 8.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
