Разработка способа получения гибридной лактазы с помощью рекомбинантного штамма-продуцента (1094961), страница 3
Текст из файла (страница 3)
Штамм DH5a –индукция; термолиз (75оС, 45 мин), 9.Маркер мол. веса (Taq полимераза,94,5кДа).Таким образом, полученный нами химерный белок имеет оптимальные дляE. coli кодоны и трансляция гена данного белка в этих клетках предельноэффективна. Поэтому, кроме времени индукции на этот процесс можетзначительно повлиять в основном лишь конечная концентрация индуктора. Как и в§ 1.1. было показано значительное улучшение продукции белка при увеличенииколичества индуктора ИПТГ с минимальных конечных значений 0,1мМ домаксимальных – 0,5мМ.1.3.3.3.
Оптимизация ионного состава ростовой среды.Анализ экспериментальных данных из § 1.1., показывает то, чтоэффективность гетерологичной экспрессии гена белка ДСД-сп-β-ГАЛ, такжедолжна быть выше в присутствии ионов двухвалентных металлов (Ca2+ и Mn2+), какуже было отмечено ранее это, вероятно, связано с тем, что данные ионы находятсяв составе простетических групп фермента, определяя правильный фолдинг(пространственную укладку) конечного белкового продукта. В соответствие с полученными данными в состав ростовой среды LB, навремя индукции включали 10мМ СаCl2, 10mM MnCl2 и 0,5 мМ ИПТГ, а такжеувеличили время индукции с 3 до 15 ч., при этом была получена экспрессиярекомбинантного белка на оптимальном уровне 10% от тотального белка клетки.Таким образом, был создан штамм-продуцент белка ДСД-сп-β-ГАЛ и былиоптимизированы условия его экспрессии.2.
Изучение физико-химических свойств белковой конструкции ДСД-сп-βГАЛ.2.1. Анализ растворимости и термостабильности белка ДСД-сп-β-ГАЛ влизатах клеток E. coli штамма DH5a. Pис. 8. - Анализ растворимости белкаДСД-сп-β-ГАЛ, экспрессия в E. coliDH5a в 10% ПААГ с SDS.1. Штамм E. coli DH5a – индукция, безтермолизиса, 2. Штамм DH5a [pGD10]– до индукции, без термолизиса, 3.Штамм DH5a [pGD10] –индукция, безтермолизиса, 4. Штамм DH5a [pGD10]– супернатант, индукция, термолизис(75оС, 45 мин), 5.
Штамм DH5a[pGD10] – супернатант, до индукции,термолизис (75оС, 45 мин), 6. ШтаммDH5a [pGD10] – осадок, до индукции,термолизис (75оС, 45 мин), 7. ШтаммDH5a [pGD10] –осадок, индукция,термолизис (75оС, 45 мин), 8. Маркермол. веса (Taq полимераза, 94,5кДа).Для анализа физико-химических свойств белка ДСД-сп-β-ГАЛ была изученаего растворимость в клетках E. coli штамма DH5a (Рис.
8.). Суть методазаключается в изучении распределения целевого белкового продукта междуосадком и супернатантом, после термолизиса и последующего осаждения.Изучение растворимости белка ДСД-сп-β-ГАЛ в клетках E.coli штамма DH5aпоказало, что химерный белок синтезируется на 70% в растворимой форме (Рис.8,трек№4).Поскольку одной из функциональных составляющих полученного белкаявляется аутентичная аминокислотная последовательность термостабильного фермента бета-галактозидазы, поэтомуфункция термостабильности являетсядоминантной и переходит на химерный белок в целом.
Для доказательства этогопредположения клеточные осадки подвергали ультразвуковой дезинтеграции итермолизу в течение 45 мин. при 75оС с последующим осаждением в полецентробежных сил, после чего собирали супернатант (растворимая фракция белка).Т.к. растворимость белка при термолизе составила порядка 70 %, это говорило оего выраженной термостабильности (рис 7; 8).2. 2.
Изучение ферментативной активности белка ДСД-сп-β-ГАЛ в лизатахклеток E. coli штамма DH5a.Благодаря термостабильности полученного белка для изучения его свойствне требовалось прибегать к сложным системам очистки. Осадок клеток былзаморожен, затем ресуспендирован в рабочем буфере «В» (10 мM Tris-HCl, pH7.4;MgCl2 10 мM; ZnCl2 1 мM ; EDTA 1 мM; β-меркаптоэтанол 1 мM; 0.1% Tween 20;0.1% (v/v) Triton X100) с лизоцимом в концентрации 1мг/мл, после чего былповторно заморожен при –70oC, что способствовало более полному и мягкомуразрушению клеточных структур для освобождения целевого продукта. Последанных манипуляций лизат клеток был прогрет в течение 45 мин. при 75оС и послеосаждения при центрифугировании в супернатанте присутствовал целевой белок вдостаточном количестве для изучения его ферментативной активности.
Излитературных источников известно, что наиболее высокую удельную активностьпосле лактозы фермент β-галактозидаза проявляет на бесцветном химическомсубстрате ОНФГ, который в её присутствии гидролизуется до галактозы иокрашенного в желтый цвет о-нитрофенила, количество которого можно измеритьна спектрофотометре по поглощению при 420 нм. Экстраполируя эти данные наполученный химерный белок ДСД-сп-β-ГАЛ было решено изучить субстратнуюспецифичность и его ферментативную активность на хромогенном гомологелактозы-ОНФГ.Приэтомаликвотысупернатантаснашимбелкоминкубировались в присутствии ОНФГ (4 мг/мл) в течение 15 мин. , 30 мин., 1 ч., 2ч. при 25, 55 и 75оС, при широком диапазоне рН (4,5 – 9,0).
В ходе развитияжелтого окрашивания реакция прерывается добавлением инактиватора 1M Na2CO3.В каждой пробирке с соответствующим разведением белка измеряем оптическую плотность при λ= 420 нм. Измеряемая величина складывается из поглощения онитрофенола (420нм) и рассеяния света клетками (600нм) [100]. Используя этиданные, можно вычислить истинное поглощение о-нитрофенола, или – в условныхединицах – активность фермента в 1мл раствора (α), по следующей формуле: 1000 * D 420 (1)t *V * D600где D420– измеренные значения для реакционной смеси, D600 отражает плотностьклеточной суспензии перед определением, 1000 – из расчёта того, что при полнойиндукции получается около 1000 ед.
активности, t – время реакции в мин. и υ –объём культуры, взятой для определения, в мл. Эта величина пропорциональнаувеличению количества о-нитрофенола в 1 мин. на одну бактериальную клетку[Craven G.R. et al., 1965]. Таким образом, была изучена удельная βгалактозидазная активность белка ДСД-сп-β-ГАЛ в динамике, которая составила 5ед.ак./мкл, при этом было доказано, что максимальная его активность сохраняласьв широком диапазоне рН, даже в ходе 2-х часовой инкубации при 75оС.2.3.
Хроматографическое выделение белка ДСД-сп-β-ГАЛ и изучение егодекстрансвязывающих свойств.Данное исследование являлось чрезвычайно важным этапом работы, т.к. онопозволило не толькополучитьрекомбинантный белок ДСД-сп-β-ГАЛ впрепаративных количествах, но и изучить его декстрансвязывающие свойства. Дляпланирования стратегии хроматографической очистки белка на ионообменникахбыл необходим расчёт изоэлектрической точки и изучение аминокислотногосостава нашего белка. Изоэлектрическая точка белковой конструкции былаопределенапосредствомпрограммыдляобработкибиоинформационныхпоследовательностей DNASIS v 2.5 Hitachi Software Endgineering Co., Ltd.
инаходилась в пределах 5,54. Кроме того, данный пакет программ позволилосуществить трансляцию нуклеотидной последовательности, что дало возможностьизучить аминокислотный состав полученного белка: положительнозаряженныеаминокислоты– Arg (R) – 4%; His (H) – 3,4%; Lys (K) – 6,8%;отрицательнозаряженные аминокислоты – Asp (D) – 7,4%; Cys (C) – 1,0%; Glu (E) –6,8%; Tyr (Y) – 5,9%. 2.3.1. Катионообменная хроматографияВыбор катионообменной хроматографии обусловлен достаточно высокимсодержаниемвцелевомбелкеположительнозаряженныхаминокислотныхостатков. Ионообмен проводили на катионообменной смоле СМ-Toyopearl (TosohBioscience LLC). Элюированный градиентом соли (0 М - 1,0 М NaCl в рабочембуфере) белок обессоливали посредством гельфильтрации на полистирольномсорбенте HW50-Toyopearl (Tosoh Bioscience LLC) после чего он был осаждёнвысаливанием с помощью 3M (NH4)2SO4 с последующим досаждением в полецентробежных сил (10 мин., при 4000 об/мин).
После измерения массыполученного белкового осадка его растворяли в конечном буфере Buf.B (рН7,4), доконечной концентрации 1 мг/мл.2.3.2. Изучение декстрансвязывающих свойств целевого белка.Рис.9 – Изменение оптической плотности (OD)от времени контакта сорбента сраствором белка.Сорбционную активность исследуемого белка по отношению к декстранупроводили в статических условиях, для чего сорбент (декстран Sefhadex G75) вколичестве 0,5 г смешивали с 5 мл раствора белка в Buf.B, полученного послекатионообменной хроматографии (1,0 мг/мл).
Сорбент оставляли в контакте сраствором на 0,5-6,0 часа (37оС) при перемешивании. Затем, суспензию помещалив микроколонку (100x10мм), продолжая инкубацию.При этом периодическиэлюировали самотёком по 1 мл раствора через нижний штуцер микроколонки,проводя определение содержания в пробах остаточного белка методом Бредфорд с использованием калибровочных кривых [Bradford M.M., 1976]. OD растворовизучали методом колориметрии по изменению оптической плотности при длиневолны 595 нм.
На рис. 9. показана зависимость оптической плотности от времениконтакта образца сорбента с раствором белка, на графике видно, что оптическаяплотность исследуемых образцов (элюатов) со временем уменьшается, что говорито способности химерного белка, за счёт наличия в нём декстрансвязывающегодомена сорбироваться на декстране.Рис. 10 – Изотерма адсорбции исследуемого белка.Оптимальное время адсорбции белка составляет около 4-6 час. Дальнейшееконтактированиесорбента с раствором белка не дает существенных измененийоптической плотности.Адсорбционную емкость сорбентов определяли по формуле:А=Сн СкVm(2)где Сн – начальная концентрация белка в растворе, мг/л;Ск – конечная концентрация белка в растворе, мг/л;m - навеска сорбента, г;V - объем раствора белка, л.Изотермаадсорбцииобразцабелка,экспериментальных данных показана на рис.10. рассчитаннаяисходяизСтепень связывания белка из раствора определяли по формуле:σ=Сн Ск 100%Сн(3)Проведенные исследования показали, что степень связывания белкадекстраном составила σ ≈ 62%, что говорило о эффективности аффинногосвязывания рекомбинантного белка ДСД-сп-β-ГАЛ с декстраном.3.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
