Разработка способа получения гибридной лактазы с помощью рекомбинантного штамма-продуцента (1094961), страница 4
Текст из файла (страница 4)
Изучение степени очистки белка ДСД-сп-β-ГАЛ посредством аффиннойхроматографии на декстране.Наколонку(100x10мм)ссорбентом(декстранSefhadexG75)уравновешенную Buf.B наносили 2 мл лизата клеток с белком. Сорбент оставляли вконтакте с лизатом на 4,0 часа (37оС). Затем, колонку отмывали от клеточногодебриса тремя объёмами рабочего буфера, аффинно связавшийся на сорбенте белокэлюировали с колонки градиентом NaCl 0-3М.При скорости элюирования 20 см3/ч проводили сбор фракций (λ = 250 нм).Для выявления целевой фракции наносили по 12 мкл каждой на 12% ПААГ вприсутствии SDS с окраской по Кумасси.
Далее, после объединения фракций смаксимальнымколичествомбелкаосвобождалисьотNaClприпомощигельфильтрации. На следующем этапе белок концентрировали высаливанием доконцентрации1мг/мл.Наконечномэтапепроизводилосьсравнительноеисследование степени очистки белка в 10% ПААГ, после катионообменнойаффинной хроматографии (рис.11). Pис. 11. - Сравнение методов очисткибелка, в 12% ПААГ с SDS.1. Штамм E.
coli DH5a – индукция (2мкл),2. Штамм DH5a [pGD10] – индукция,после хроматографии на CM-Toyopearl, 3.Штамм DH5a [pGD10] – индукция, послеаффинной хроматографии на декстране, 4.Штамм E. coli DH5a – до индукции (4мкл). иСравнительное исследование показало высокую константу связыванияхимерного белка с декстраном в широком диапазоне ионной силы (0-3М NaCl), атакжепреимуществаtag-аффиннойхроматографиинадекстраненадкатионообменной, т.к.
степень очистки в первом случае составила 90%, что на 2025% выше, чем после катионообмена.4. Сравнение зависимости ферментативной активности белков ДСД-сп-β-ГАЛи LacZThEh от времени, pH и температуры.На данном этапе исследования, относительно положительного контроля, вкачествекоторогоThermoanaerobacterвыступалаethanolicusтермостабильная(LacZThEh),былибета-галактозидазаполученыграфическиезависимости активности очищенного рекомбинантного фермента ДСД-сп-β-ГАЛ оттаких физических характеристик как температура, время и рН среды (рис.12).
Приэтом, за 100% активности была принята активность бета-галактозидазы LacZThEh,рассчитаннаяпри15мин.инкубацииеёссубстратомОНФГ.В опыте были определены зависимости активности ферментов от величиныpH, времени и температуры. При этом было установлено, что максимальнаяактивность фермента ДСД-сп-β-ГАЛ смещена относительно контроля в щелочнуюобласть (LacZThEh ) и наблюдается в диапазоне pH 7,0 – 8,0. При этом 70% и болееактивности сохранялось при рН 6,8- 8,2 (рис.12а.). Тип графической зависимости активности химерного фермента от еготемпературного оптимума сходен с таковым у положительного контроля, однакоприэтом,такженаблюдаетсянезначительноесмещениелинииграфикаотносительно контрольного фермента (LacZThEh).При этом температурный оптимум полученной нами белковой конструкциинезначительно уступал контролю и варьировался в пределах 60 – 750С (рис.12б.). Всоответствие с полученными данными, рекомбинантный белок ДСД-сп-β-ГАЛ, посвоей стабильности во времени, имел незначительные преимущества передконтрольным образцом, сохраняя высокие показатели активности после 5-тичасовой инкубации (при оптимальных для него условиях: 65-70оС; рН 7,4), однакопо прошествии этого периода, практически дублировал данные полученные дляконтроля (рис.12в.).5.
Оптимизация условий получения комплекса декстрана и рекомбинантногобелка ДСД-сп-β-ГАЛ.Завершающимэтапомданнойработыявилосьсозданиемодельнойколоночной системы для ферментации бета-галактозидов, на базе комплексадекстрана и рекомбинантного белка ДСД-сп-β-ГАЛ. Pис. 13. - Анализ лактазной активности комплексадекстрана и белка ДСД-сп-β-ГАЛ, посредствомтонкослойной хроматографии.1. К1 (–) отрицательный контроль 1% лактоза, 2. К2(–) отрицательный контроль 6% лактоза, 3.
К1 (+)положительный контрольсмесь галактозы иглюкозы 1%, 4. К2 (+) положительный контрольсмесь галактозы и глюкозы 6%, 5. Опытный образец(лактоза (1%) + декстран-белковый комплекс), 6.Опытный образец (лактоза (6%) + декстран-белковыйкомплекс),Использование в составе химерной конструкции ДСД позволяет не толькоэффективно выделить и очистить белок от примесей штамма продуцента, но ииммобилизовать его на декстране посредством аффинного взаимодействиядекстрансвязывающего домена.
Принимая в расчёт данные, полученные в исследованиях, проведённых на предыдущих этапах, для исследований былавыбрана колонка (100x10мм), которая заполнялась сорбентом (декстран SefhadexG75) и уравновешивалась Buf.B. На колонку наносили 2 мл раствора белка(1мг/мл), оставляя белок в контакте с сорбентом в течение 4,0 часов (37оС). Затем,колонка отмывалась тремя объёмами рабочего буфера, который полностьюудалялся с последующим подсушиванием комплекса в колонке, после чего черезколонку с декстран-ферментным комплексом последовательно пропускалисьрастворы 1 и 6% лактозы, (t=60-65оС).
Собранные элюаты с продуктамирасщепления лактозы оценивались посредством тонкослойной хроматографии(ПТСХ-АФ-А-УФ"Merck")(рис.13).Наследующемэтапечерезрасконсервированную колонку, при тех же условиях, были пропущены растворыОНФГ (0,4мг/мл) и Xgal (1мг/мл). После прохождения через декстран-белковыйкомплекс, в ходе гидролиза хромогенных субстратов, образовывающийся в случаеОНФГ - 2-нитрофенол, окрашивал элюат и декстран в колонке в насыщенныйжёлтый цвет, в то время как накапливающийся в результате гидролиза Xgal - 5,5'дибром-4,4'-дихлор-индиго, придавал декстрану и элюату голубой оттенок.Пропускание через колонку 50 объёмов раствора лактозы и ОНФГ при скоростиэлюции 10 см3/ч и температуре 65оС не приводило к значительному снижениюэффективности ферментативного гидролиза бета-галактозидов, при этом значениярасчётной удельной активности в опытах приближались к первоначальномууровню и в пересчёте на массу фермента в декстран-белковом комплексесоответствовали 3-5 ед/мкг, это следовало из того расчета, что адсорбционнаяёмкость, исследованная ранее составляла 6,2 мг белка на 1г сорбента, т.е., учитываяреальный коэффициент гидратации сорбента (15-20 мл/г) - 0,2 – 0,4 мкг белка на 1мкл водного декстрана.
Также в процессе проведённых нами исследований быларассчитанаконстантаМихаэлиса-Ментенферментавдекстран-белковомкомплексе, составившая 9,5х10-4. Было установлено, что свободный химерныйбелок за период десятичасовой инкубации при 65-700С, рН 7,4 и оптимальномионном составе терял 50% своей активности, в то время как эта же белковаяконструкция, но иммобилизованная на декстране утрачивала лишь 5-10% своейудельной активности. Таким образом, суммируя полученные данные тонкослойнойхроматографии и хромогенного проточного гидролиза можно говорить о том, что полученный нами рекомбинантный химерный белок ДСД-сп-β-ГАЛ способеноставаться в стабильном комплексе с декстраном и в течение длительного времениосуществлять гидролиз различных бета-галактозидов.По результатам настоящей работы нами были поданы две заявки на патент.ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ВЫВОДЫ1) РазработанспособполученияотличающегосягибридногоналичиембелкааутентичнойДСД-сп-β-ГАЛ,последовательностидекстрансвязывающего домена, объединённой через глицин-сериновыйспейсер с последовательностью термостабильной бета-галактозидазы2) Сконструирована экспрессионная плазмида pGD-10, кодирующая химерныйбелок ДСД-сп-β-ГАЛ.3) Создан штамм E.coli [pGD-10] - продуцент белка ДСД-сп-β-ГАЛ.Оптимизированыусловияиндукцииисинтезахимернойбелковойконструкции, вследствие чего был достигнут уровень экспрессии целевогобелка 10% от общего белка E.
сoli.4) Определены физико-химические показателии удельная ферментативнаябета-галактозидазная активность гибридного белка ДСД-сп-β-ГАЛ.5) Получен комплекс декстрана и белка ДСД-сп-β-ГАЛ, который может бытьиспользован в качестве компонентной базы для ферментативного гидролизаразличных бета-галактозидов в пищевой промышленности и медицине.ОСНОВНЫЕ ПУБЛИКАЦИИ1) Гришин Д.В. Характеристика термостабильных гистоноподобных белков изразных биологических источников.
В сб. тезисов: VI Молодёжной научнойконференции«Биотехнологияврастениеводстве,ветеринарии», М., Россия, 5 апреля 2006, С 7-9. животноводствеи2) Гришин Д.В. Разработка новой химерной белковой конструкции длягидролиза бета-галактозидов // Антибиотики и химиотерапия. - 2009. - Т 54. С. 3-7.3) Гришин Д.В., Никитин А.В. Перспективы профилактики и лечения синдромамальабсорбции // Антибиотики и химиотерапия.
– 2009. - №3-4, С 49-51.4) Гришин Д.В., Никитин А.В. Создание химерной белковой конструкции длятвердофазного гидролиза бета-галактозидов и изучение её физико-химическихсвойств // Естественные и технические науки. – 2009. - № 5, С 131-133.5) Гришин Д.В., Никитин А.В., Бирюков В.В. Создание новой рекомбинантнойбелковой конструкции для ферментативного гидролиза бета-галактозидов . Всб.
тезисов: XII Всероссийской молодежной школы-конференции поактуальным проблемам химии и биологии, МЭС ТИБОХ, Владивосток, 7–14сентября 2009, С 17. .
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
