Диссертация (1091824), страница 5
Текст из файла (страница 5)
Этанолпри этом осушенный.24Литературныйисточник[8][46]3.15 мин промывка этанолом,затем 3 раза по 30 минфосфатным буфером4.15 мин промывкаизопропанолом, затем 3 разапо 30 мин фосфатнымбуфером15 мин промывкаизопропанолом, затем 3 разапо 30 мин фосфатнымбуфером и еще 2 раза по 60мин фосфатным буфером5.6.7.8.9.10.Используют 2 мл10ммолярногофосфатного буфера срН 5.6 при 37°С на25 мг волос.Используютфосфатный буфер срН 6 при 37°С.[9]Используютфосфатный буфер(рН 6) с добавлением0.01% бычьегосывороточногоальбумина (БСА) при37°С.0,1% додецил сульфат натрия Используетсяв воде, а затем промывкавыдержка вчистой водой три разаультразвуковой бане.Промывка диэтиловымэфиром, а затемхлороформомПромывка гексаном, затемацетономПромывка 10 мл 10%додецилсульфата, затем 2раза по 10 мл водой и 10 млацетона в течение 3 минПромывка 5 мл хлороформа,5 мл воды и 5 мл метанола[16][7][56][59][16, 84][26][22, 31]Следует отметить что, несмотря на все исследования эффективностиописанных выше методов отмывки волос, необходимо проводитьинструментальный контроль полноты отмывки перед тем, как приступать кдальнейшим стадиям подготовки волос к анализу с целью избежатьложноположительных результатов анализа внутренней области.251.4.4 Подходы к изолированию веществ из матрицы волосВолосы представляют особый вид биологического объекта, так как посвоим физическим свойствам являются твердым веществом.
И, как уже былоописано выше, все экзогенные вещества связаны непосредственно с ихструктурой. В связи с этим требуются особые подходы к извлечениюэкзогенных ксенобиотиков из матрицы волос, которые существенногоотличаются от методов пробоподготовки биологических жидкостей.Самым первым и до сих пор наиболее распространенным способомразрушения структуры волос является механическое измельчение. Здесьможет быть использовано простое нарезание волос ножницами на фрагментыдлиной до 0,5-5 мм [48].
Также в литературе описан необычный способрастирания волос в агатовой ступке в присутствии битого стекла [92].Однако благодаря развитию новых технологий наиболее популярным измеханических способов разрушения структуры волос становитсяизмельчение с помощью шаровой мельницы. Причем измельчение можнопроводить как с охлаждением жидким азотом, так и без него.После таких механических способов разрушения структуры волоса, какправило, проводят настаивание полученной фракции либо в органическихрастворителях (метанол, ацетонитрил и т.д.) [18, 25, 32, 40, 43, 64, 66, 75, 84]либо в слабых водных растворов кислот (соляной, муравьиной и т.д.).
Влитературе [17, 36, 44, 53, 74] также встречаются методы так называемогоферментативного гидролиза волос. В этом случае измельченные волосывыдерживают в растворах фосфатного буфера с добавлениемсоответствующихферментов(β-глюкуронидаза,арил-сульфотаза,протеиназы и т.д.). Данные способы извлечения экзогенных веществ изматрицы волос достаточно продолжительны по времени, т.к. занимают всреднем 24-48 часов.Существует еще один альтернативный способ экстракции экзогенныхвеществ из волос – щелочной гидролиз [15, 17-20, 26, 41, 46, 48-50, 57, 59, 71,78, 86, 87].
Это наиболее быстрый и наименее трудозатратный метод.Преимущество этого метода состоит в том, что не требуется механическогоизмельчения волос, т.к. щелочь в различных концентрациях, как принагревании, так и без него способна растворять волосы. При этом время напроведения такой экстракции составляет в среднем 1-2 часа.Выбор наиболее подходящего способа изолирования экзогенных веществиз матрицы волос во многом зависит от природы целевых аналитов. Втаблице 1.4.4.1 представлены данные по способам экстракции аналитов из26волос,используемыеанализируемых веществ.исследователямидляразличныхклассовТаблица 1.4.4.1 Экстракция аналитов из волосКласс веществОпиатыСтимуляторыЦНСОсновныепредставителиСпособ экстракцииэкзогенных веществ1.Механическоеизмельчение волос спомощью ножниц либошаровой мельницы споследующейвыдержкой:а) в воде при 37°С втечение 18 часов;б) в 0,1 N фосфатномбуфере с рН 5;в) в метаноле при 45°Св течение несколькихчасовг) ферментативныйгидролиз (протеиназаили глюкуронидаза/арилсульфотаза)д) в 0,1 М водномрастворе солянойкислоты в течение ночи2.
Растворение в 1Мгидроксиде натрия втечение 1-3 часовМорфинКодеинГероинФентанилыМетадонМеханическоеизмельчение волос спомощью ножниц либошаровой мельницы споследующейвыдержкой:Кокаин27Литературныйисточник[48][46, 51, 65][33, 60,83][36, 44, 53][18, 31, 39,45, 56][18, 76, 49,87][32, 66, 84,а) в метаноле при 3760°С на ночь;б) в 0,01-0,1 М водномрастворе солянойкислоты при 45-60°С втечение 12-16 часов;в) в 37% солянойкислоте при 100°С втечение часа;г) в буферном растворепротеиназы;д) в фосфатном буферес рН 5-6 на ночь.КаннабиноидыСтимуляторыамфетаминовогоряда1. Механическоеизмельчение волос спомощью ножниц либошаровой мельницы сТетрагидроканнаби последующейнолвыдержкой:Каннабинола) в метаноле приКаннабидиолтемпературеТГК-кислотаб) ферментативныйгидролиз.2.
Щелочной гидролизв 1-10 М гидроксиденатрия.1. Щелочной гидролизв 1М растворегидроксида натрия;2. Механическоеизмельчение волос спомощью ножниц либошаровой мельницы споследующейвыдержкой:а) в метаноле вультразвуке;б) в 0,25 М водномАмфетаминМетамфетаминМДАМДМАМДЕА2875, 25, 18][21, 12, 31,56, 65, 79 ][17][36, 74][70, 76][40][17][20, 57, 71,59, 15, 17,86][19, 50, 26,85, 78, 37,48][64, 75]растворе солянойкислоты при 45°С втечение ночи.β-блокаторы1. Щелочной гидролизв 1М растворегидроксида натрия при100°С в течение 10минут.2. Механическоеизмельчение волос спомощью ножниц либошаровой мельницы споследующейвыдержкой в смесиметанол:вода (1:1) при40°С в течение 4 часов.АцебуталолАтенололБетаксололБисопрололЛабеталолМетопрололОкспренололПиндололПропранололСоталолТимолол[80][41, 46][43]Следующий этап пробоподготовки волос к анализу – очистка полученныхэкстрактов.1.4.5 Очистка экстрактовМетод очистки экстрактов направлен либо на выделение целевых аналитовиз растворов, полученных любым способом, описанным в п.
1.3.4, либо наудаление компонентов матрицы волос, мешающих идентификации аналитовв ходе инструментального анализа. Здесь, как правило, используется дваосновных метода: жидкость-жидкостная (ЖЖЭ) или твердофазная (ТФЭ)экстракция.Жидкость-жидкостнаяэкстракция—процессраспределениярастворенного вещества между двумя несмешивающимися жидкими фазами,одной из которых в большинстве случаев являются водные растворы, авторой — несмешивающийся с водой органический растворитель.Выбор органического растворителя для проведения ЖЖЭ зависит отприроды целевого аналита. Чаще всего используются смеси двух или болеерастворителей.В литературе [7-13, 15, 22, 28, 32, 36, 50, 64, 70, 73] описано применениеЖЖЭ после выдержки измельченных волос в водных растворах кислот, атакже после ферментативного и щелочного гидролизов.
В этом случаепредварительно доводят рН экстрактов (гидролизатов) до необходимоуровня, который рассчитывается по формуле:29рН = рКа ± 2(1.4.5.1)где рКа – константа ионизации целевого аналита; «+» используется для веществосновной природы, «−» − для кислой природы.В качестве растворителей для ЖЖЭ чаще всего используют следующиесистемы:смесь гексан:этилацетат в различных соотношениях;смесь диметилового и метилтретбутилового эфиров;смесь хлороформ: изопропанол.ЖЖЭ − простой и быстрый способ очистки экстрактов, но недостаточноэффективный. Альтернативой жидкость-жидкостной является твердофазнаяэкстракция [31, 49, 58, 59, 76].Метод ТФЭ основан на распределении целевого компонента междуподвижной и неподвижной фазами в результате сорбционных и/илиионнобменных процессов, протекающих в специальной колонке (картридже)для ТФЭ.Различают два основных раздела твердофазной экстракции.
Припроведении удерживающей ТФЭ целевой компонент сначала удерживаетсяна сорбенте, при этом мешающие примеси сорбентом не удерживаются, азатем происходит элюирование (смывка) целевого компонента. Принеудерживающей ТФЭ на сорбенте сразу оседают мешающие примеси, ацелевой компонент проходит через колонку, не удерживаясь.
Таким образом,достигается его очистка от мешающих примесей.Пробы большого объема могут быть обработаны с использованиемсравнительно малых количеств твердой фазы, что в свою очередь требуетмалогообъемарастворителейдляпоследующейдесорбциисконцентрированных соединений, снимает необходимость дополнительноговыпаривания и существенно уменьшает риск загрязнения образца.Последовательность действий при подготовке пробы методом ТФЭ:проведение экстракции образцов;отделение исследуемого объекта от мешающих примесей;концентрирование образца.Преимущества ТФЭ в сравнении с жидкостно-жидкостной экстракцией:селективность и специфичность;более глубокое разделение;высокое количественное извлечение исследуемого образца(> 75%);отличная воспроизводимость;легкость в обращении;возможность оптимизации;30экономия дорогих растворителей.Выбор картриджей для ТФЭ зависит от природы аналита.
В таблице 1.4.5.1приведены существующие фазы картриджей ТФЭ [31, 49, 58, 59, 76].Таблица 1.4.5.1. Обзор коммерчески доступных картриджей ТФЭТорговыеФазаМатрицаПрименениеназваниякартриджейОбращенно-фазные картриджиHR-Xполистиролдля нейтральных иCHROMABOND®дивинилбензоль- полярных веществ,HR-X,ный полимернапример, пестициды,OASIS® HLB,фенолы, лекарственные ENVI-Chrom Pпрепараты.PS-RP полистиролдля удаленияBond Elute® ENV,дивинилбензоль- органических примесей, Bond Elute® LMS,ный полимергидрофобные.BakerbondTM H2Ophobic DVB,Isolute® 101C18 ec силикагельдля неполярныхBond Elute® С18,гидрофобныхCLEAN-UP® C18,взаимодействий сBakerbondTMорганическимиOctadecyl, Isoluteвеществами, например,C18(EC), ENVI-18амфетамины, никотин,антибиотики,барбитураты и др.C18силикагельдля полярныхIsolute C18,гидрофобныхAccubond® C18,взаимодействий сBakerbondTMорганическимиPolarPlusвеществами, например,амфетамины, никотин,антибиотики,барбитураты и др.C8силикагельдля гидрофобныхBond Elute® С8,соединений, подходитENVI-8,для веществ, которыеAccubond® C8,слишком сильноBakerbondTM Octyl,31C6H5SiOHNH2взаимодействуют ссорбентом С18Силикагельфенольное кольцообеспечивает наиболееселективное в отличие отС8 гидрофобноевзаимодействие сафлотоксинами,кофеином, фенолами.Нормально-фазные картриджисиликагельpH стабильность впределах 2-8,применяются дляафлотоксинов,пестицидов, стероидов,витаминов.силикагельpH стабильность впределах 2-8, слабыйанионообменник,используется длясвязывания липидов.OHсиликагельдля высокомолекулярныхсоединенийCNсиликагельдля гидрофобногополярноговзаимодействия сцелевыми веществамиFlorisilсиликат магниядля извлеченияполярных соединений изнеполярнойорганической матрицы32Isolute C8(EC)Bond Elute® PH,Accubond® Phenyl,BakerbondTMPhenyl,Isolute PH(EC),CLEAN-UP®PhenylBond Elute® silica,CLEAN-UP® silica,Accubond® silica,BakerbondTM silicagel,Isolute® silicaBond Elute® NH2,CLEAN-UP®aminoproyl,Accubond® NH2,BakerbondTMamino, Isolute® NH2Accubond® Diol(OH)Bond Elute® CN-U,CLEAN-UP® CN,Accubond® CN,BakerbondTM cyano,Isolute® CNBond Elute®Florisil, CLEANUP® Florisil,Accubond® Florisil,BakerbondTMFlorisil, Isolute®FlorisilSAXSCXPSAMCXИонообменникисиликагельчетвертичноаммонийнаягруппа всегда остается взаряженном состоянии,что позволяет ейсвязываться с анионамипри любых условиях.Походит для веществ,обладающих слабымикислотными свойствами.силикагельбензол сульфоновыекислые группы сорбентаобеспечиваютсвязывание свеществами,обладающимислабоосновнымисвойствами, например,антибиотики,гербициды,аминокислоты и др.силикагельЯвляетсяанионообменником,используется дляудаления органическихкислот и пигментов изорганических образцов,например, фруктов иовощей.полистиролpH стабильность вдивинилбензоль- пределах 1-14,ный полимерприменяются дляизолирования сильныхкатионов из водных иорганических матриц.Нашли особоеприменение дляизолирования33Bond Elute® SAX,CLEAN-UP®Quaternary Amine,Accubond® SAX,BakerbondTMQuaternary Amine,Isolute® SAXBond Elute® SСX,CLEAN-UP®Benzenesulfonicacid, Accubond®SCX, BakerbondTMAromatic Sulfonic,Isolute® SCXBond Elute® PSA,SuperClean TM PSA,Accubond® PSAOasis® MCXPS-OH(MAX)DrugDrug IIлекарственныхпрепаратов и ихметаболитов избиологическихжидкостей.полистиролpH стабильность вOasis® MAXдивинилбензоль- пределах 1-14,ный полимерприменяются дляизолирования сильныханионов из водных иорганических матриц.Нашли особоеприменение дляизолированиялекарственныхпрепаратов и ихметаболитов избиологическихжидкостей.Специализированные картриджиСиликагельсостоят из смеси С8 иBond Elute®MCX.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
