Диссертация (1091405), страница 11
Текст из файла (страница 11)
Предварительновзвешенные образцы пленок (по пять образцов на каждый состав) помещали всоответствующие водные растворы и ставили сосуды в термостат. Температуратермостатирования составляла 37°C. Измерение массы образцов проводили втечение 6 месяцев (180 сут) с интервалом в 15 сут.57Степень набухания вычисляли как отношение разности конечной иначальной масс каждого образца к начальной массе в процентах с нахождениемсреднего арифметического значения для всех пяти образцов.Определение адгезии модельных бактерий к поверхности покрытийВсе испытания на культурах клеток и микроорганизмов проводили набазахЦентрабиотехнологийэкспериментальнойиВсероссийскогоэмбриологииирепродуктивныхнаучно-исследовательскогоинститутатехнологии консервирования.Дляопределенияадгезиимодельныхмикроорганизмовобразцыпокрытий помещали в суспензию соответствующих бактерий.
В качествемодельных бактерий были выбраны Escherichia coli (кишечная палочка) иStaphylococcusaureusстафилококк)(золотистыйкакпредставителиграмотрициательных и грамположительных бактерий соответственно.Для приготовления суспензий брали 100 мкл суточной бульоннойкультуры на 100 мл стерильной воды. Затем готовили плотную питательнуюсреду (L-агар) и разливали в чашки Петри. Образцы покрытий площадью 2×2см погружали в суспензию бактерий на 2 сек и на 72 ч. По истечениивыбранного времени контакта производили смыв стерильной водой, чтобыубрать излишки суспензии и смыть бактерии, которые не закрепились наповерхности материала. Термостатирование образцов проводили при 37°С вшейкере. После смыва в воде делали реплики образцов на плотной питательнойсреде, L-агаре, которые термостатировали в течение 24 часов.
Адгезиюбактерий к покрытию определяли по числу колониеобразующих единиц (КОЕ)путем визуального подсчета числа колоний на репликах образца при осмотрепокрытия через оптический микроскоп.Определение угнетения бактерий дисково-диффузионным методомДисково-диффузионныйвизуальногоопределенияАгаризованнуюметод(методугнетенияпитательнуюсредудиска)используетсяисследуемыхинокулировалидлямикроорганизмов.исследуемымимикроорганизмами (E. coli, S.
aureus) глубинным способом заражения. После58застывания агара на его поверхность наносили образцы пленок. Посевытермостатировали при 37°С в течение 24 часов. В качестве учета результатовисследования смотрели зоны просветления на агаре с помощью оптическогомикроскопа. По наличию зон задержки роста судили об угнетении тестмикроорганизмов относительно исследуемых пленок.Растровая электронная микроскопия поверхностиРастровую электронную микроскопию (РЭМ) покрытий проводили набазеМосковскогогосударственноготехническогоуниверситетаимениН.Э. Баумана.Принципэлектронов,действияРЭМобразующихсяпризаключаетсяврегистрациивзаимодействиивторичныхэлектронногозонда(первичного высокоэнергетического пучка электронов) с материалом образца, ив построении топографии образца в просканированной зоне.
Для испытанияиспользовали образцы пленок размером 1×1 см и толщиной 100 мкм.Термогравиметрический анализ пленокПринциптермогравиметрическогоанализа(ТГА)заключаетсявполучении зависимости массы образца материала от температуры. Похарактеру изменения массы в зависимости от температуры можно не толькоопределить термостойкость материала, но и получить ценные данные о егоструктуре.Для испытания были изготовлены образцы пленок в форме диска,соответствующие по диаметру тиглю дериватографа. В качестве рабочейгазовой среды дериватографа был выбран аргон во избежание усложнениякартины изменения массы образцов с увеличением температуры за счетокислительных процессов, происходящих в присутствии кислорода воздуха.Образцыпомещаливтигельдериватографаирегистрироваливавтоматическом режиме изменение массы образца в зависимости оттемпературы. Также были получены дифференциальные кривые ТГА,демонстрирующие зависимость скорости изменения массы от температуры.59Определение молекулярной подвижности методом электронногопарамагнитного резонансаИсследование пленок методом электронного парамагнитного резонанса(ЭПР)проводилинабазеИнститутабиохимическойфизикиимениН.М.
Эмануэля РАН.Основой метода ЭПР является анализ вращательной подвижностипарамагнитных частиц (стабильных радикалов) в изучаемой среде.Для испытания были подготовлены образцы пленок площадью 2×2 см итолщиной 50 мкм. В качестве зонда использовался стабильный нитроксильныйрадикал 2,2,6,6,-тетраметилпиперидин-1-оксил (ТЕМПО).
Для введения зондаобразец пленки помещали в закрытый сосуд вместе с небольшим количествомрадикала при температуре 70°С, после чего образец выдерживали в течениеопределенного количества времени, необходимого для сорбирования образцомдостаточного количества радикала.Спектр ЭПР регистрировали в трехсантиметровом диапазоне с помощьюспектрометра «ЭПР-В». По значению времени корреляции вращения зондаоценивали интенсивность вращательного движения радикала в среде.Значения времени корреляции вращения зонда (τ) в области быстрыхвращений (5×10-11<τ<10-9 с) определяли из спектров ЭПР по формуле:τ = ∆Н+ × [(I+/I–)0,5 – 1] × 6,65 ×10-10,(1)где ∆Н+- ширина компоненты спектра, расположенной в слабом поле,I+/I– — отношение интенсивностей компонент в слабом и сильном полесоответственно.Определение клеточной токсичности покрытийКлеточную токсичность (цитотоксичность) покрытий определяли in vitroсогласноГОСТРИСО10993.5-99(Изделиямедицинские.Оценкабиологического действия медицинских изделий.
Часть 5. Исследование нацитотоксичность: методы in vitro).Дляопределенияцитотоксическогодействияпокрытийбылииспользованы субкультивированные после размораживания замороженной60культуры мезенхимальные стволовые клетки костного мозга крупного рогатогоскота (МСК). Размораживание, культивирование, субкультивирование культурклетокосуществлялипроводилинапостандартныхстандартнымсредахбезпротоколам.добавленияКультивированиеантибиотиковиантимикотиков. Перед испытанием все образцы были обработаны этанолом.Образцыпокрытийбылипомещенынамонослойклетокконфлюэнтностью 75-95% в чашках Петри.
Для контроля использоваликультуры клеток без образцов (на стекле). После 24 часов культивированияклеток вместе с образцами провели визуальную оценку и фотодокументацию спомощью инвертированного микроскопа. По полученным фотографиямвизуально оценивали влияние материалов на рост (пролиферацию) клеток.Жизнеспособность клеток определяли спустя 48 часов культивированияпутем визуального подсчета погибших клеток, ядра которых окрашивалифлуоресцентным красителем (иодидом пропидия), и вычислением процентапогибших клеток по отношению к контролю.613. Экспериментальная часть3.1. Обоснование выбора направления и объектов исследованияПроблема защиты полимерных материалов от образования биопленок наних рассматривается, как правило, применительно к медицинским материалам,и то в основном в зарубежной литературе, когда как она актуальна и в другихсферах применения изделий из полимеров, в том числе и из эластомеров.Общепринятым подходом к решению проблемы защиты изделий отприкрепления бактерий и образования ими биопленки на поверхностиполимерных материалов является объемная модификация материала свведением так называемого «высвобождающегося» (англ.
«releasing»), т.е.вымывающегося в рабочую среду антибактериального агента [20]. Основнымнедостатком этого подхода является низкая скорость диффузии агента в толщематериала по сравнению со скоростью вымывания агента в среду. Вместе с тем,известны способы борьбы с биопленками путем создания антибактериальныхповерхностей, у которых происходит медленное разрушение (окислительнаядеструкция или гидролиз) поверхностного слоя полимерного материала врабочей среде [20, 96-110]. Образующийся при этом промежуточный слой,состоящей из компонентов рабочей среды и продуктов деструкции/гидролизаполимера, не только препятствует эффективному прикреплению клетокбактерий к поверхности, но и способствует смыву клеток в среду, особенно припостоянномилипериодическомдвижениисреды.Такойтипантибактериальной поверхности носит название «самоочищающейся» (англ.self-polishing) и разработан достаточно хорошо для ряда твердых полимерныхматериалов. Между тем, в литературе скудно представлены сведения оэластомерных материалах с функцией самоочищения поверхности, чаще всегоупоминаются твердые полимерные материалы [20].
Также важным способомзащиты является создание антиадгезионных, «отталкивающих» (англ. repelling)поверхностей,которыенеимеютпригодныхдлябактерийцентров62прикрепления и/или выделяют в рабочую среду вещество (репеллент),блокирующее адгезионно-активные участки клеток [44-93].Классические эластомерные материалы (резины из каучуков общего испециальногоназначения,блок-сополимерныетермоэластопласты,силиконовые резины и др.), контактирующие с нестерильными средами имогущие поэтому служить субстратом для прикрепления бактерий иобразования бактериальных пленок, не могут подвергаться достаточной дляэффекта самоочищения деструкции поверхностного слоя в рабочей воднойсреде. Данные по самоочищению таких эластомерных материалов в литературеотсутствуют, хотя с другой стороны для большинства их них подчеркиваетсятакоесвойство,какводостойкость[121,122,138].Единственнымипромышленными эластомерными материалами, которые могут обладатьсклонностьюкгидролизувводнойсреде,являютсяполиуретаныопределенного химического строения [121, 122].
Однако такие полиуретанынужно специально синтезировать, так как промышленные марки полиуретановразрабатываются, наоборот, с упором на повышенную водостойкость.Проблема использования эффекта самоочищения для защиты поверхности отприкрепления бактерий заключается также в том, что деструкция материалавлечет за собой медленное, но необратимое изменение свойств материалаизделия с постепенным выходом его из строя. Но в большинстве случаевповерхностная деструкция приводит лишь к истончению слоя материала безсущественного изменения его свойств [20, 107, 119].Антиадгезионныеповерхности,рассматриваемыевлитературе,представляют собой, как правило, химически модифицированные поверхноститвердых или эластичных полимерных материалов, а именно — поверхности спривитым гидрофильным полимером, таким как полиэтиленгликоль илинекоторые биополимеры [81, 84, 89].
Мы считаем, что проблему можно решить63проще, используя антиадгезионный вымывающийся «репеллент» в сочетании сдругими типами антибактериальных поверхностей.Нами предложено нанесение на изделия эластомерных покрытий,невосприимчивых к образованию на них биопленок. Покрытия могут бытьнанесены на эластомерное изделие практически любой конфигурации, ссохранением исходных свойств, характерных для материала изделия, иприданием поверхности стойкости к образованию биопленок.При создании материала для покрытий предполагали использованиекомплексного подхода, учитывающего все рассмотренные выше.
Так, гидролизповерхностного слоя у такого материала должен не только способствоватьобразованию слабого переходного слоя, непригодного для крепления бактерий,но и будет также приводить к вымыванию (высвобождению) новых и новых«порций» антибактериального агента. Попавший в рабочую среду агент будетугнетать рост и размножение бактерий, в зависимости от характера егоантимикробного действия. Для вымывания в рабочую среду данный агентдолжен быть водорастворимым. Важно также усилить защиту поверхности отобрастания бактериями, применив принцип антиадгезионной поверхности, еслиобеспечить вымывание репеллента из поверхностного слоя материала. Дляэтого нами использованы различные поверхностно-активные вещества.Оптимальным представляется применение агента, который одновременнообладает антибактериальными и антиадгезионными свойствами.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
