Иммобилизация биологических компонентов
2.4 Иммобилизация биологических компонентов
Введение. Для того чтобы биосенсор надежно работал, биологический материал должен быть надлежащим образом закреплен, или иммобилизован, на трансдьюсере. Существуют пять основных методов иммобилизации биологических материалов.
1) Адсорбция. Наиболее простой метод, не требующий большой
подготовки компонентов сенсора. Адсорбцией пользуются, главным
образом, на стадии исследований, когда достаточно слабого прикрепления биологического материала к трансдьюсеру, а от сенсора не требуется длительной эксплуатации.
2) Микрокапсулирование. Этот метод широко использовали в первых моделях биосенсоров. Он позволяет заключить биологический материал с внутренней стороны мембраны в близком контакте с трансдьюсером. Метод легко применить к разным моделям сенсоров, он
обеспечивает хорошую воспроизводимость работы фермента, предохраняя его от загрязнений и разрушения. В целом, микрокапсулированные ферменты устойчивы к изменениям рН, температуры, ионной силы и химического состава среды. Тем не менее, некоторые молекулы и частицы (в частности, небольшие молекулы газов и электроны) проникают через мембрану.
3) Включение. В методе включения биологический материал смеши-
вают с раствором мономера, а затем к раствору добавляют инициатор
полимеризации, в результате чего образуется гель, в который включен
биоматериал. К сожалению, через такие гели часто плохо диффундиру-
ют субстраты, что замедляет ферментативную реакцию. Кроме того, со
временем фермент может вытекать из геля, что приводит к уменьше-
нию биологической активности распознающего элемента. Впрочем,
скорость потери фермента можно существенно снизить за счет сшивки
(см. ниже). Чаще всего в качестве геля используют полиакриламид.
Кроме него, применяются гели на основе крахмала, нейлона и крем-
ний-органических полимеров. В электрохимических биосенсорах осо-
бую роль играют гели на основе проводящих полимеров (например, по-
ли пирролов).
4) Сшивка. В этом методе биоматериал химически связывают с
твердыми подложками или гелями, для чего используют так называе-
мые бифункциональные реагенты (например, глутаровый альдегид).
Как и в случае капсулирования, диффузия субстратов через полученные
материалы может быть довольно медленной, а биологически активные
соединения в них могут постепенно разрушаться. Кроме того, недос-
татком метода являются плохие механические характеристики матери-
алов. Вместе с тем, метод может быть полезен для повышения стабиль-
ности адсорбированных биоматериалов.
5) Ковалентное связывание. В этом подходе заранее известно, через
какие функциональные группы биоматериал прикрепляется к носите-
лю. В случае ферментов для этого часто используют нуклеофильные
группы тех аминокислот, которые не принимают участия в образова-
нии активного или связывающего центров. В качестве примера приве-
дем прикрепление аминосодержащего биоматериала к носителю, несу-
щему карбоксильные группы. Как показано на рисунке 3.18, карбок-
сильные группы носителя сначала активируются с помощью
карбодиимида, а затем полученное производное реагирует с аминог-
руппами с образованием амидной связи. Реакцию проводят при низкой
температуре, небольшой ионной силе и нейтральном рН. Метод позволяет создавать биосенсоры, в которых фермент остается связан-
ным с носителем втечение всего срока эксплуатации сенсора.
Рис. 2.15. Ковалентное связывание фермента с трансдьюсером с помощью карбодиимида
Рекомендуемые материалы
В целом, срок службы биосенсора можно существенно увеличить за
счет правильно выбранного метода иммобилизации. Приведем типич-
ные сроки эксплуатации биосенсоров с разными методами иммобили-
зации биологического материала:
| Адсорбция | 1 сут |
| Микрокапсулирование (включение мембрану) | 1 нед |
| Включение (в гель) | 3-4 нед |
| Ковалентное связывание | 4-14 мес |
2.4.1 Адсорбция
Ферменты адсорбируются на поверхности многих материалов. В числе таких материалов — алюминий, уголь, глина, целлюлоза, каолин, силикагель, стекло, коллаген и др. Для адсорбции не требуется ни дополнительных реагентов, ни отдельной стадии очистки. Метод практически не нарушает нативной конформации фермента.
Адсорбция может быть физической или химической (хемосорбция).
При физической адсорбции между биоматериалом и носителем образу-
ются относительно непрочные связи. Она протекает главным образом
благодаря взаимодействиям ван-дер-Ваальса, реже — с участием водо-
родных связей и взаимодействий с переносом заряда. Существенно бо-
лее прочно биоматериал связывается в результате хемосорбции, проте-
кающей с образованием ковалентных связей.
Для описания адсорбционных процессов предложено несколько
моделей, но наиболее часто пользуются изотермой адсорбции Лэнгмюра.
Это уравнение связывает долю поверхности носителя, занятую адсор-
бированным материалом (9), с рядом кинетических параметров. Оно
выводится следующим образом:
Поскольку в равновесии скорости адсорбции и десорбции равны,
получим:
где: ра— парциальное давление адсорбента; kа — константа скорости
адсорбции; kd — константа скорости десорбции; К — константа, равная
отношению ka/kd.
Адсорбированный биоматериал очень чувствителен к изменениям
рН, температуры, ионной силы и концентрации субстрата. Однако ме-
тодом адсорбции вполне можно пользоваться в исследовательских це-
лях для получения сенсоров, от которых не требуется длительного срока
эксплуатации.
2.4.2 Микрокапсулирование
Этот метод позволяет заключить биоматериал с внутренней стороны инертной мембраны вблизи трансдьюсера. С применением этого метода был получен первый глюкозный биосенсор на кислородном электроде. В числе достоинств метода можно назвать следующие:
1) Метод позволяет достичь тесного взаимодействия между биома-
териалом и трансдьюсером;
2) Он обеспечивает высокую надежность и пригоден для разных ти-
пов сенсоров;
3) Надежность работы биоматериала (фермента) определяется сле-
дующими факторами:
■ сохранением высокой специфичности;
■ высокой стабильностью при изменениях температуры, рН, ион-
ной силы, потенциала Е° и концентрации субстрата;
■ повышенной устойчивостью к загрязнениям и биодеструкции;
4) Биологический компонент может быть связан с проводящим по-
лимером (например, с полипирролом).
При микрокапсулировании используют несколько типов мембран.
Помимо мембран из ацетата целлюлозы (диализных), не пропускающих
молекулы белков и замедляющих транспорт многих низкомолекулярных
соединений (например, аскорбата), применяют также мембраны из по-
ликарбоната (Nucleopore), природного белка коллагена и политетра-
фторэтилена (Teflon) — синтетического полимера, проницаемого лишь
для некоторых газов (например, для кислорода). Иногда используют так-
же мембраны из полимера Nafion и полиуретанов.
2.4.3. Включение
В этом методе биоматериал включают внутрь полимерного геля. Чаще всего используют полимерные гели из полиакриламида, которые получают сополимеризацией акриламида и N,N'-метиленбисакриламида,например, под действием УФ-излучения в присутствии витамина В, в качестве фотосенсибилизатора. Использовали также гели из крахмала, нейлона, кремний-органических полимеров и проводящих полимеров (например, полипиррола).
К возможным недостаткам метода можно отнести следующие:
1) Диффузия субстрата через гель часто бывает затруднена, что сни-
жает скорость ферментативной реакции, а, следовательно, и время от-
клика биосенсора.
2) Фермент может постепенно вытекать через поры в геле. Во избе-
жание вытекания фермент можно сшить глутаровым альдегидом или
другим реагентом.
2.4.4 Сшивка
В этом методе для иммобилизации биоматериала на твердом носителе используют бифункциональные реагенты. Метод оказался весьма полезным для стабилизации адсорбированных на поверхности носителя
ферментов. Однако он имеет ряд недостатков:
1) При сшивке может происходить потеря активности фермента.
2) В полученных распознающих элементах может быть затруднена
диффузия субстрата.
3) Элементы характеризуются пониженной механической проч-
ностью.
На рис. 2.16 представлены структуры некоторых бифункциональ-
ных реагентов — глутарового альдегида (сшивающего фермент по пер-
вичным аминогруппам), гексаметилендиизоцианата и 1,5-динит-
ро-2,4-дифторбензола.
Рис. 2.16. Некоторые реагенты, применяемые для образования сшивок
2.4.5 Ковалентное связывание
Функциональные группы аминокислот, не имеющие значения для каталитической активности фермента, можно задействовать для ковалентного связывания с подложкой (трансдьюсером или мембраной). Для того используют такие нуклеофильные группы, как NH2, СООН, ОН, С6Н4ОН, SH, а также имидазольную группу.
На рисунке 2.17 представлены химические реакции, чаще всего
применяемые в рамках этого метода. Реакции следует проводить в мяг-
ких условиях, то есть при невысокой температуре, низкой ионной силе
и значениях рН, близких к физиологическому.
Главное достоинство метода состоит в том, что в получаемом био-
сенсоре фермент надежно закреплен на подложке и не высвобождается
в процессе эксплуатации сенсора. Для того чтобы защитить активный
участок фермента в процессе иммобилизации, ее часто проводят в при-
сутствии субстрата.
Рис. 2.17. Некоторые химические реакции, часто применяемые для ковалентного связывания фермента с подложкой
а) — цианбромидный метод; б) — карбодиимидный метод
Рис. 2.17. Некоторые химические реакции, часто применяемые для ковалентного связывания фермента с подложкой
Если Вам понравилась эта лекция, то понравится и эта - 23 Молоко и его первичная обработка.
в) — метод с применением гидразина и азотистой кислоты;
г) — метод с применением цианурхлорида;
Рис. 2.17. Некоторые химические реакции, часто применяемые для ковалентного связывания фермента с подложкой
д) — образование диазониевых групп из аминогрупп ароматических аминокислот;
е) — связывание через тиольные группы.
