Биологическое распознавание молекул
2.3 Биологическое распознавание молекул
Именно биологические объекты в основном используются в качестве распознающих элементов в биосенсорах. Главное требование к ним состоит в том, чтобы узнавать только один субстрат среди множества других. Этому требованию отвечают четыре типа объектов:
■ ферменты;
■ антитела;
■ нуклеиновые кислоты;
■ рецепторы.
Сенсоры на основе антител или рецепторов иногда называют аффинными биосенсорами.
В распознающих элементах биосенсоров чаще всего используют
ферменты. Они могут присутствовать как в виде очищенной субстанции, так и в составе микроорганизмов или интактной ткани. Ферменты ускоряют протекание биохимических реакций и специфически связываются со своими субстратами. В биосенсорах их используют именно благодаря их каталитическому действию.
Антитела действуют по-другому. Они специфически связываются с определенными антигенами, но, как правило, не обладают каталитическим действием. Несмотря на это, они могут обеспечивать исключительно высокую селективность биосенсора. В подобных биосенсорах используются специальные методы регистрации сигнала, возникающие в результате связывания антитела с антигеном.
Рекомендуемые материалы
В гораздо меньшей степени в биосенсорах используют нуклеиноые кислоты. Селективность подобных биосенсоров основана на спаивании нуклеотидов. Возможно, они найдут применение в диагностике наследственных заболеваний, в особенности, у детей.
Для создания селективных биосенсоров можно использовать и клеточные рецепторы. Это — белки, которые часто пронизывают липидный бислой клеточной мембраны и характеризуются высокоспецифическим связыванием с лигандами. К сожалению, процедура их выделения в чистом виде очень трудоемка. Вместе с тем, они могут обеспечить тот же уровень аффинности и селективности, что и антитела.
2.3.1 Ферменты
Ферменты представляют собой биологические макромолекулы большого размера и состоят главным образом из белковых компонентов. Часто в них также имеется так называемая простетическая группа, которая может включать один или несколько атомов металла. Для многих ферментов (особенно, применяемых в биосенсорах) в ходе катализируемого ими превращения происходит реакция окисления или восстановления, которая может быть обнаружена электрохимически.
Классический случай ферментативного катализа описывается
сравнением:
где: S - субстрат; Е - фермент; ES - фермент-субстратный ком-
плекс; Р - продукт.
Например, в случае, если S - глюкоза, Е - глюкозооксидаза (GOD),
Р - глюконовая кислота, уравнение будет выглядеть следующим об-
разом:
Предположим, что эта реакция быстро достигает стационарного
состояния, при котором концентрация фермент-субстратного ком-
плекса не меняется, то есть скорость его образования равна скорости
его распада с образованием продукта и исходного фермента. В этом слу-
чае имеем:
В стационарном состоянии эти скорости равны, поэтому можно за-
писать:
Обозначим общую концентрацию фермента [Е0]. Она складывается из концентраций свободного фермента и фермент-субстратного комплекса, то есть:
В этом случае кинетическое уравнение реакции можно записать в
виде:
Из этого уравнения можно выразить [ES]:
Если теперь ввести обозначение KM=(k-1+k2)/k1 (так называемая
константа Михаэлиса), получим:
Таким образом, общая скорость реакции (то есть скорость образо-
вания продуктов) определяется следующим уравнением (уравнение
Михаэлиса-Ментен):
В том случае, если [S] »Км, скорость ферментативной реакции мак-
рмальна: Vmax = k2[Е0]. При [S] = Км скорость реакции равна половине
от максимальной (v = Kmax/2), что хорошо иллюстрируется кривой, по-
данной на рисунке 2.13. Уравнение Михаэлиса—Ментен можно пре-
образовать к виду, который позволяет определять значения КM и k2 из
kинейных графиков.
Рис. 2.13. Зависимость скорости ферментативной реакции от концентрации субстрата при постоянной концентрации фермента
При построении зависимости 1/v ot 1/[S] получается прямая, а со-
ответствующий график называют графиком Лайнуивера—Берка. Та-
кая прямая отсекает на оси ординат отрезок, равный 1/Vмах, а угол ее
наклона составляет Км/Vмах. На практике, однако, в указанных коор-
динатах часто получаются нелинейные графики, в частности, из-за
ингибирования фермента продуктами реакции или посторонними со-
единениями.
Наиболее широко используемые биосенсоры с применением фер-
ментов — биосенсоры на глюкозу и мочевину.
2.3.2Ткани
Ткани растений и животных можно использовать почти без обработки. Вообще говоря, в тканях содержится множество ферментов, поэтому по сравнению с очищенными ферментами они не столь специфичны.Однако в тканях ферменты находятся в естественном для них окружении и поэтому часто более устойчивы. В связи с этим, срок эксплуатации тканесодержащих сенсоров должен быть выше. С другой стороны, время отклика подобных сенсоров может быть больше, поскольку субстрату приходится диффундировать через ткань. Кроме того, в биосенсоре фермент может присутствовать в большем количестве, если он находится в очищенном виде, а не в составе ткани. Мы рассмотрим ряд примеров, на которых можно сравнить аналитические характеристики биосенсоров, изготовленных с использованием как тканей, так и очищенных ферментов.
Ферменты содержатся как в микроорганизмах, так и в тканях животных и растений. Однако различное окружение ферментов в этих источниках может влиять на параметры получаемых с их помощью биосенсоров. И ткани, и микроорганизмы дешевле очищенных ферментов, а содержащие их биосенсоры характеризуются повышенным сроком эксплуатации. Благодаря естественному окружению ферменты в них меныпе подвержены инактивации под действием рН и температуры, а также ингибированию посторонними веществами. Основной недостаток биосенсоров, содержащих ткани и микроорганизмы, - относительно низкая селективность, связанная с присутствием смеси ферментов впрочем, иногда ферменты в такой смеси оказываются близкими по своим свойствам). В качестве примера приведем биосенсор на основе пульпы банана, который был разработан в 1985 г. Сидвеллом и Райхни, а затем в 1988 г. усовершенствован Вангом и Лином. В пульпе банана содержатся полифенолазы, катализирующие окисление полифенольных соединений. Этот биосенсор был предложен для определения дофамина — катехоламина мозга. Впоследствии оказалось [Эггинс, 1994], что он столь же эффективен для определения как самого катехола, так и флаванолов — производных катехола, которые в качестве отдушек присутствуют в пиве и вине. Таким образом, в некоторых случаях неабсолютной селективностью биосенсора можно с успехом воспользоваться. Ниже перечисляются достоинства и недостатки применения растительных материалов в качестве распознающих элементов биосенсоров.
2.3.3 Микроорганизмы
Микроорганизмы широко применяются в биотехнологической промышленности, в частности, в пивоварении, производстве пищевых продуктов и лекарственных препаратов, при обработке сточных вод иполучении энергии. Для мониторинга многих биотехнологических процессов разработаны биосенсоры, в которых в качестве распознающего элемента применяются микроорганизмы, иммобилизованные на трансдьюсере. Действие микроорганизмов основано на том, что в результате усвоения ими органических веществ изменяется их дыхательная активность. Кроме того, продуктами их метаболизма могут служить электроактивные соединения.
Можно выделить следующие достоинства использования микроорганизмов в биосенсорах:
1) они служат относительно дешевым источником ферментов (по
сравнению с очищенными ферментами);
2) они в меньшей степени ингибируются растворенными вещества-
ми и более стабильны при изменениях рН и температуры;
3) биосенсоры на основе микроорганизмов характеризуются более
длительным сроком эксплуатации.
Основные недостатки подобных биосенсоров:
1) они иногда характеризуются большим временем отклика;
2) они медленнее регенерируют;
3) как и ткани растений и животных, микроорганизмы содержат много разных ферментов, что может ухудшать селективность биосенсора.
2.3.4 Митохондрии
Митохондрии - клеточные органеллы, содержащие множество разных ферментов могут служить эффективными биокатализаторами. С их помощью можно улучшить характеристики сенсора (в частности, величину отклика и селективность) в тех случаях, когда использование интактной ткани не позволяет достичь нужного результата. В таблице 4.2 сравниваются каалитические характеристики разных биосенсоров на глутамин (в том числе на основе митохондрий).
2.3.5 Антитела
Вероятно, антитела — это наиболее универсальные биологические реагенты, которые могут обеспечить необходимую селективность.(Антитело (Аb) можно получить практически к любому веществу или антигену (Ag). По своему составу антитела являются гликопротеинами; их структура представлена на рисунке 3.14.
Рис. 2.14. Схематическое изображение типичной молекулы антитела, состоящей из двух тяжелых и двух легких цепей
Организм вырабатывает антитела против чужеродных антигенов в целях самозащиты — они связываются с антигеном и выводят его из организма:
Константа ассоциации для этой реакции, К = [Ab-Ag]/[Ab][Ag],
может составлять от 106 до 109 М-1. При фиксированной концентрации
антитела отношение концентраций свободного и связанного антигена,
[Ag]/[Ab—Ag], при достижении равновесия определяется суммарным
количеством антигена ([Ag] + [Ab—Ag]). Поэтому анализ с использованием фиксированного количества антител позволяет определить неизвестную концентрацию антигена.
С использованием меченных антител или антигенов можно также
определять неизвестную концентрацию антител. В качестве метки могут
послужить радиоактивные изотопы, ферменты, эритроциты, флуоресцентные или хемилюминисцентные молекулы, а также металлы. В основном, в биосенсорах используют антитела, меченные ферментами. Антитела можно иммобилизовать практически на всех типах трансдьюсеров.
Биосенсоры с антителами в качестве распознающего элемента имеют следующие достоинства:
1) Они исключительно селективны;
2) У них очень высокая чувствительность;
3) Они прочно связываются с антигеном.
К их недостаткам можно отнести отсутствие каталитического дей-
ствия.
Антитела уже давно применяются в иммуноанализе. Их связывание
с антигенами прочнее и специфичнее, чем связывание большинства
ферментов с субстратами. Часто они настолько селективны, что по-разному реагируют на два разных штамма одного и того же микроорганизма (в ряде случаев это может быть недостатком биосенсора). Для них характерна очень высокая чувствительность определения субстрата, но уих нет каталитической активности ферментов, поэтому их часто применяют в виде конъюгатов с ферментами.
2.3.6 Нуклеиновые кислоты
Как и антитела, нуклеиновые кислоты обладают способностью специфично связываться с лигандами. Спаривание цепей нуклеиновых кислот лежит в основе образования ДНК — носителя генетической информации, определяющего врожденные характеристики организма. Для каждого белка (а значит, и фермента), синтезируемого в клетках организма, существует специфическая последовательность нуклеотидов,кодирующая этот белок.
ДНК-зонды можно использовать для выявления наследственных
болезней, рака и вирусных инфекций. Они могут представлять собой
как короткие синтетические фрагменты нуклеиновых кислот (олигонуклеотиды), так и длинные фрагменты, получаемые клонированием
ДНК. Как и вслучае антител, при анализе ДНК в определяемый раствор
добавляют меченный ДНК-зонд. В качестве метки можно использовать
радиоактивные изотопы, ферменты, флуоресцентные или электроак-
тивные молекулы. Соответственно, различными могут быть и типы
ДНК-биосенсоров.
Современные ДНК-технологии, применяемые в генной и белковой
инженерии, могут оказаться полезными и для разработки биосенсоров.
Вот лишь некоторые направления, в которых они могут применяться.
Повышение выхода фермента. Некоторые полезные ферменты присутствуют в биологических источниках в очень малом количестве, и их
трудно выделить. В качестве примера можно привести глюкозодегидрогеназу (GDH), которую можно использовать в биосенсорах на глюкозу.
В отличие от глюкозооксидазы, для ее работы не требуется кислорода
или другого окислителя. Один из источников GDH — бактерия
Acinetobacter calcoaceticus, но фермент присутствует в ней в очень малых
количествах. С помощью методов генной инженерии в бактерию мож-
но включить до 50 копий плазмиды, кодирующей GDH, тем самым зна-
чительно повысив ее выход.
Улучшение свойств фермента. Изменить свойства фермента можно
либо модифицируя молекулу самого фермента химическими или фи-
зическими методами, либо внося модификации в ген этого фермента.
Такие модификации могут положительно влиять на (а) быстроде-
йствие фермента, (б) его рН-зависимость, (в) зависимость скорости
катализируемой реакции от концентрации субстрата, (г) стабильность
фермента в условиях хранения и эксплуатации, (д) чувствительность к
примесям, (е) субстратную специфичность, (ж) зависимость фермента
от кофакторов.
Хотя в этих направлениях уже достигнуты огромные успехи, для со-
здания новых биосенсоров они применяются пока мало и лишь эпизо-
дически.
Рекомендуем посмотреть лекцию "24 Группа блоков создания и уничтожения транзактов".
2.3.7 Рецепторы
Рецептор — это белковая молекула, расположенная в клеточной мембране. Как правило, после связывания рецептора с лигандом (агонистом) в клетке запускается каскад событий, который приводит к определенному физиологическому ответу. В ответ на связывание с агонистом
могут происходить такие события, как (а) открытие ионного канала, (б)
синтез вторичных посредников и (в) активация ряда ферментов. Обычно биологические рецепторы могут связываться не с одним лигандом, а
с несколькими структурно родственными соединениями. Это свойство
часто бывает привлекательно для их применения в биосенсорах. Как
правило, подобные биосенсоры используют, добавляя в испытуемый
раствор меченные лиганды. Поначалу использовали, главным образом,
радиоактивные метки, но теперь выпускаются также лиганды, меченные флуоресцентными красителями и ферментами. Возможны и такие
варианты анализа, когда в раствор добавляют меченный рецептор.
Рецептор-содержащие биосенсоры можно разделить на две большие группы в зависимости от того, используются в них интактные (на-
ходящиеся в составе мембраны) или очищенные рецепторы.
Для детекции местных анестетиков использовали систему, содер-
жащую гигантские аксоны лангуста. Детекция основана на том, что
анестетик связывается с рецептором, ассоциированным с потенци-
ал-зависимым натриевым каналом, который отвечает за проведение
возбуждения по нерву. Таким образом, связывание анестетика уменьшает скорость проведения возбуждения. Эту же систему можно
использовать для детекции нейромодуляторов и токсинов, к которым
относятся многие антидепрессанты, наркотики, спирты и яды. Все эти
вещества влияют на проведение возбуждения. К сожалению, названные
системы детекции можно применять лишь в течение 4—8 ч.
Из очищенных рецепторов в биосенсорах более всего применяли
N-холинорецептор. Его использовали в сочетании с несколькими
трансдьюсерами, в том числе с ионоселективным полевым транзисто-
ром (ИСПТ). Но наилучших результатов удалось добиться в случае
определения флуоресцентно-меченных лигандов с помощью биосен-
сора, в котором N-холинорецептор использовался в сочетании с оптро-
дом на основе волоконной оптики (см. главу 5). Срок эксплуатации по-
добного биосенсора для определения FITC-меченного α-конотоксина
составлял 30 суток.
Потенциал использования рецепторов в биосенсорах очень велик,
по до полной его реализации пока еще далеко.
