Часть 3

2.3.4. Пространственная структура белковой молекулы

Полипептидная цепь нативного белка (белка, сохранившего структуру присущую ему в живой клетке) в нормальных биологических условиях - обычная температура и нейтральные значения рН имеет, как правило, одну к о н ф о р м а ц и ю, называемую н а т и в н о й (натуральной, естественной). Эта нативная конформация достаточно устойчива. Существуют первичная, вторичная, третичная и , введенная в 1958 г. Берналом, четвертичная структура белковой молекулы. Рассмотрим каждую из этих структур. П е р в и ч н а я   с т р у к т у р а  -  это число и последовательность расположенния аминокислотных остатков, образующих полипептидную цепь белковой молекулы. Для первичной структуры характерны только ковалентные связи (включая и дисульфидные мостики) и поэтому ее обозначают как ковалентную структуру.

Белки отличаются друг от друга по первичной струтуре. Соединяя аминокислоты в различном порядке, можно получить почти бесконечное число последовательностей и , значит, почти бесконечное множество разнообразных белков. также идентичны цитохромы С коровы, овцы и свиньи. Следовательно, первичная структура гомологичных белков может быть применена в качестве критерия для установления родства между отдельными видами живых существ.

Первичная структура белков - основа для определения более высоких уровней их пространственной организации.

В т о р и ч н а я   с т р у к т у р а  -  это способ укладки остова (стержня, хребта) полипептидной цепи без учета укладки радикалов. Она включает два различных типа регулярных структур, встречающихся во многих белках: спиральные структуры и структуры складчатого слоя (листа).

Из спиральных структур признанной является  a-спираль (спираль Полинга и Кори). Она стабилизирована водородными связями, образованными между находящимися поблизости СО- и NH-группами пептидных связей данной полипептидной цепи. При этом кислород каждой СО-группы образует водородную связь с водородом четвертой по ходу цепи NH-группой. Благодаря   a-спирали белковая молекула напоминает растянутую пружину (рис 2.1). Один виток спирали включает 3,6 остатка аминокислот (11 атомов полипептидной цепи), высота одного витка по оси (шаг спирали) равна »0,54 нм, вертикальный прирост, соответствующий одному аминокислотному остатку, составляет 0,15 нм; внутренний диаметр спирали равен 1,01 нм. Водородные связи приблизительно параллельны оси спирали.

Другой тип вторичной структуры -  b-структура (или структура складчатого листа) стабилизирован водородными связями, возникающими между СО- и  NH-группами прилегающих друг к другу различных полипептидных цепей или различных участков одной и той же полипептидной цепи.

Рис. 2.1. Структура a-спирали. А. Показаны a-атомы углерода. Соединяющая их линия описывает a-спираль. Б. Часть a-спирали в растянутом виде. Спираль стабилизирована водородными связями.

В пространственном представлении  b-структура обнаруживает “плиссированность” (складчатость), причем радикалы аминокислотных остатков стоят попеременно с разных сторон складчатого листа (рис 2.2). В зависимости от взаимного положения атомов в разных цепях или участках одной цепи возможно существование двух типов складчатого листа. Если обе цепи направлены в одну сторону, такое расположение  называют           п а р а л л е л ь н ы м,  если  цепи  направлены  в  противоположные  стороны  - а н т и п а р а л л е л ь н ы м.

Рекомендуемые материалы

Рис 2.2. Структура складчатого листа.

 А.Показано расположение на листах атомов двух антипараллельных полипептидных цепей. Б. Схематическое изображение структуры складчатого листа. Водородные связи между СО-  и  NH-группами обозначены пунктиром.

Т р е т и ч н а я    с т р у к т у р а - это способ компактного расположения в пространстве всех атомов и групп полипептидной цепи, имеющей вторичную структуру. Эта структура трехмерна и характеризует конформацию молекулы белка в целом. В стабилизации третичной структуры участвуют водородные связи как между пептидными группами, так и радикалами аминокислотных остатков, ионные дисульфидные связи, гидрофобное взаимодействие и некоторые другие связи (рис 2.3).

Важное значение в формировании третичной структуры белковой молекулы имеют последовательность аминокислотных остатков полипептидной цепи, размер, форма и полярность радикалов аминокислотных остатков. При формировании третичной структуры большая часть гидрофобных радикалов располагается внутри белковой молекулы; полярные (гидрофильные) радикалы находятся на ее поверхности, т.е. поверхность молекулы белка преимущественно гидрофильна.

Рис 2.3.Схема третичной структуры белка.

1.Водородные связи b-структуры.  2.Водородные связи между R-группами аминокислотных остатков. 3. Водородные связи a-спирали. 4. Гидрофобные взаимодействия. 5. Солевые (ионные) связи. 6. Дисульфидные связи.

Ч е т в е р т и ч н а я   с т р у к т у р а. Белки, имеющие молекулярную массу более 50000 состоят из двух или нескольких отдельных полипептидных цепей и называются   л и г о м е р н ы м и. Ранее указывалось, что отдельные полипептидные цепи в таких белках называют п р о т о м е р а м и, а функциональные части  -                               с у б ъ е д и н и ц а м и. Субъединицы могут состоять из одной или более полипептидных цепей. Каждая из полипептидных цепей, образующих субъединицу, характеризуется своей первичной, вторичной и третичной структурами.

Наиболее часто в составе олигомерных белков содержится 2 или 4 протомера, реже - от 6 до 12 или 24 и в редчайших случаях их число может быть нечетным. Между собой отдельные протомеры соединяются водородными, ионными, гидрофобными и другими нековалентыми связями.

Способ совместной упаковки и укладки в пространстве полипептидных цепей олигомерного белка в его нативной конформации называют   ч е т в е р т и ч н о й   с т р у к т у р о й. Эта структура олигомерных белков определяется первичной структурой, входящих в их состав протомеров.

Классическим примером белка, для которого методом рентгено-структурного анализа М.Перуц и его сотрудники установили третичную и четвертичную структуры, является          г е м о г л о б и н. Молекула гемоглобина состоит из четырех полипептидных цепей - двух a-цепей (по 141 остатку) и двух b-цепей (по 146 остатков аминокислот), каждая из которых связана с небелковым железосодержащим веществом  -  г е м о м    ( рис 2.5). При образовании единой молекулы гемоглобина одинаковые цепи ( a - a  и  b - b) мало соприкасаются и между ними осуществляется лишь ион-ионное взаимодействие конце-вых групп. В то же время между a-  и  b-цепями образуется большое число неполярных и водородных связей. При этом в образовании связей меж-ду a₁  и  b₁ ( a₂  и  b₂ ) димерами участвуют 34  боковых остатака, а  между a₁  и  b₂ ( a₂  и  b₁)  -  лишь 19 остатков.

Рис.2.5.Схема строения гемоглобина. Прямоугольником обозначен гем.

То обстоятельство, что крупные молекулы белков состоят обычно из нескольких полипептидных цепей, а не из одной очень длинной цепи, дает ряд преимуществ: при их биосинтезе требуется значительно меньшая генетическая информация (меньший участок структурного гена ДНК), чем при большой одноцепочечной молекуле; сводятся к минимуму появления случайных ошибок при их биосинтезе, становятся возможными регуляторные взаимодействия.

2.4.  Физико-химичекие свойства белков

2.4.1. Молекулярная масса белков. Размеры молекул белка

Молекулярные  массы  белков колеблются  от  ~ 6 000 (условно принятый нижний предел) до 1 000 000  и выше.

Молекулярные массы белков определяют с помощью специальных методов: по скорости осаждения в центробежном поле, по скорости диффузии белков в растворителе, по осмотическому давлению, на основании рентгеноструктурного анализа и др.

Белки относят к высокомолекулярным соединениям, так как их молекулярные массы колеблются от нескольких тысяч до миллионов. Размеры молекул белков составляют 1- 100 нм и соответствуют размерам частиц высокодисперсных систем. Молекулы белков вследствие необычайно больших размеров называют макромолекулами.

2.4.2. Амфотерные свойства и изоэлектрическая точка белков

Макромолекулы белков несут на своей поверхности большое количество карбоксильных и аминных групп, что придает им свойства амфотерных полиэлектролитов. Карбоксильные группы, способные к диссоциации с образованием протонов (Н⁺), определяют кислотные свойства молекулы белка; аминогруппы, способные присоединять протоны, определяют ее основные свойства.

Соотношение между количеством кислых и основных группировок варьирует у различных белков. Белки, в которых преобладают кислые группировки, имеют при рН 7 (или близких к 7) суммарный отрицательный заряд и их называют кислыми; белки, в которых преобладают основные группировки, имеют при указанных значениях рН положительный заряд и их называют основными. В живых организмах преобладают кислые белки.

В растворе молекулы белков могут менять свой заряд в зависимости от рН среды:   

         _{+                -                                             +                                   O                                                        +                                 +}

       NH₃                                        NH₃                                                   NH₃

        ½                 +H⁺                     ½                        + H⁺                       ½

^-ООС¾     ¾COO^-     ¾®   HOOC¾       ¾COO^-        ¾®   HOOC¾        ¾COOH

      при рН 7                                     при снижении рН

               _{+                          +                                                                        O                                                                                            -}

                  NH₃                                                  NH₂                                                 NH₂

               ½       ₊       + OH^-                                      ½              ₊          +OH^-                         ½

 ^¾ООС¾     ¾ NH₃                   ^¾ООС¾      ¾ NH₃                      ^¾ООС¾     ¾NH₂

                                   H₂O                                         H₂O     

    при рН 7                                        при увеличении рН

Следовательно, изменяя рН среды добавлением кислот или щелочей, можно не только уравнять положительные и отрицательные заряды на поверхности молекулы белка, но и усилить один из них или изменить на противоположный. В кислой среде молекулы белка приобретают положительный заряд и в поле постоянного электрического тока движутся к катоду; в щелочной среде они приобретают отрицательный заряд и в поле постоянного электирческого тока движутся к аноду. Передвижение заряженных растворенных частиц в поле постоянного электрического тока получило название  э л е к т р о ф о р е з а  (“движение посредством электрического поля”).

Для каждого белка (равно пептида и аминокислоты) существует рН при котором положительные и отрицательные заряды в молекуле белка уравновешиваются и суммарный заряд ее становится равным нулю. Такая молекула теряет подвижность в электрическом поле. Величина рН, при котором молекула белка не несет суммарного заряда и не движется в электрическом поле,  называется  и з о э л е к т р и ч е с к о й   т о ч к о й (ИЭТ) и обозначается рН_J; это одна из характерных констант белков.

В изоэлектрической точке белок обладает наименьшей растворимостью, легко выпадает в осадок, растворы его менее вязки. Эти явления можно объяснить отсутствием электростатического отталкивания между молекулами белка.

2.4.3. Растворимость и осаждаемость белков

Подавляющее большинство белков обладает гидрофильными свойствами, т.е. способностью легко взаимодействовать с молекулами воды. Гидрофильность белков обусловлена полярными заряженными и полярными незаряженными группами, расположенными на поверхности их молекул. Полярными заряженными группами в молекуле белка являются радикалы лизина, гистидина, аргинина, аспарагиновой и глутаминовой кислот; полярными незаряженными - радикалы серина, треонина, тирозина, цистеина, аспарагина, глутамина и др.  Гидрофильные вещества легко растворяются в воде и водных растворах.

Растворимость белков в растворителях неодинакова и зависит от многих факторов: природы, состава и рН растворителя, ионной силы и температуры раствора, структурных особенностей молекулы данного белка и других факторов. В результате чего одни белки хорошо растворимы в воде, другие - в водных растворах нейтральных солей, третьи  -  в слабых растворах кислот или щелочей, четвертые  -  в смеси воды и органических растворителей (например, этанола или ацетона). В большинстве чистых органических растворителей белки не растворяются. Среди белков есть и нерастворимые во всех перечисленных растворителях. Это связано с особенностью их структуры.

Большое значение для растворимости белка имеет ионная сила раствора ( в частности, концентрация электролита). При низких ионных  силах растворимость белка увеличивается, а при высоких - уменьшается. Зависимость раствримости большинства белков от рН при данной ионной силе описывается  U -образной кривой с минимумом растворимости вблизи изоэлектрической точки и увеличенной растворимостью при значениях рН меньше и больше изоэлектрической точки. С повышение температуры до определенной величины (например, от 0 до 25 - 40^О С) растворимость  большинства белков повышается ( это правило имеет исключение).

При растворении белков в воде и водных растворах происходит гидратация каждой белковой молекулы, т.е. взаимодействие полярных групп белка с водой. При этом например,  -СО-NH- группы связывают по одной молекуле воды, карбоксильные группы - по четыре молекулы воды, аминогруппы - по одной молекуле воды.

В результате гидратации вокруг заряженных молекул белка образуется электрозаряженный водный слой (гидратная оболочка), состоящая из молекул воды, ориентированных по отношению к молекуле белка строго определенным образом.

Чем дальше молекулы воды удалены от поверхности молекулы белка, тем беспорядочнее их расположение в растворе. Вокруг электронейтральных молекул белка гидратная оболочка не образуется.

Гидратная оболочка препятствует агрегации белковых частиц и тем самым способствует устойчивсти раствора белка. Таким образом, заряд и гидратная оболочка являются важными факторами, обусловливающими устойчивость белковых растворов.

При осаждении белков необходимо устранить факторы, обусловливающие устойчивость их растворов, т.е. разрушить гидратную оболочку и снять электрический заряд.

Разрушить гидратную оболочку можно прибавлением к раствору белка достаточно больших количеств  в о д о о т н и м а ю щ и х (дегидратирующих) веществ, таких как этанол, ацетон, сульфат аммония, нейтральные соли.

Осаждение белка из раствора при добавлении нейтральных солей  и сульфата аммония называют в ы с а л и в а н и е м . 

Разные белки высаливаются при неодинаковых концентрациях нейтральных солей. Это свойство широко используют для разделения смеси белков.

Рекомендуем посмотреть лекцию "3 Лексический анализ".

Электрический заряд можно снять добавлением к раствору белка кислоты или щелочи до рН, равной изоэлектрической точке растворенного белка. Как указывалось выше  в изоэлектрической точке отсутствует электростатическое отталкивание между молекулами белка и они легко выпадают в осадок. Поскольку разные белки имеют разные изоэлектрические точки, то их можно отделить друг от друга путем осаждения в изоэлектрической точке.

 Наиболее полное осаждение белка может быть достигнуто путем разрушения гидратной оболочки и снятия электрического заряда.

2.4.4. Коллоидные свойства белков

Растворы белков обладают  свойствами как истиных, так и коллоидных растворов. Это связано с тем, что белки в растворе диспергированы до единичных молекул, но, вследствие большой молекулярной массы и связанного с ней большого размера частиц (1 - 100 нм), растворы белков имеют коллоидный характер.

Растворы белка, в связи с коллоидным характером, рассеивают свет (явление Тиндаля), характеризуются высокой вязкостью, при определенных условиях могут терять текучесть и образовывать г е л и, или  с т у д н и  (студни, сформированные из молекул белков, рассматривают как частную форму гелей).

Молекулы белка вследствие большого размера медленно диффундируют в растворе в направлении более низкой концентрации и неспособны проникать через поры искусственных мембран из целлофана, коллодия, пергамента, а также большинства мембран клеток растений и животных. В то же время молекулы низкомолекулярных веществ (вода, этанол, соли, аминокислоты, сахара и т.п.) свободно проходят через такие мембраны.