Синтез нуклеиновых кислот и белков. Регуляция синтеза белков. Наследственные болезни. Генная терапия
Лекция «Синтез нуклеиновых кислот и белков. Регуляция синтеза белков. Наследственные болезни. Генная терапия»
Нуклеиновые кислоты – это важнейший компонент всех клеток, они являются хранителями наследственной информации, обеспечивают синтез белков, регулируя таким образом все этапы жизнедеятельности клетки. Завершившаяся программа «Геном человека» позволила идентифицировать десятки тысяч генов, кодирующих белки с разнообразными функциями, что открывает новые перспективы диагностики и лечения колоссального числа заболеваний.
Генетический материал клеток эукариот представлен ДНК ядра и митохондрий, а также различными видами РНК (матричная, транспортная, риосомальная). Нарушение структуры ядерной или митохондриальной ДНК может привести к наследственным заболеваниям, связанным с изменением синтеза или активности белков.
Ядерная ДНК, подобно белкам, имеет первичную, вторичную и третичную структуры. Последовательность чередования нуклеотидов в цепи ДНК составляет ее первичную структуру. В геноме человека около 64% составляют участки ДНК, представленные один или несколько раз (уникальные последовательности). Это – структурные гены, несущие информацию о структуре специфических белков. Остальную ДНК составляют повторяющиеся последовательности, к которым относятся структурные гены, которые кодируют продукты, необходимые клетке в больших количествах: гены рибосомных РНК, транспортных РНК, иммуноглобулины. В группу умеренно повторяющихся последовательностей входят участки ДНК, выполняющие регуляторные функции, к этой же группе относятся гены, которые представлены в виде нескольких копий и могут менять свою локализацию в геноме (мобилбные диспергированные гены). ДНК содержит обращенные повторы, или падиндромы – последовательности, повторяющиеся в обратном порядке, предполагают, что палиндромы служат для узнавания определенных участков ДНК ферментами и белками, регулирующими действие генов.
Выяснение вторичной структуры ДНК – одно из крупнейших открытий биологии прошлого века: полинуклеотидная цепь ДНК расположена в форме спирали с периодом идентичности (шагом) 3,4 нм и расстоянием между плоскостями оснований 0,34 нм, между амино- и кетогруппами азотистых оснований образуются водородные связи. Специфичность спаривания азотистых оснований обусловливает комплементарность (аденин-тимин, гуанин-цитозин). Цепи ДНК направлены противоположно друг другу. Стабильность двойной спирали определяется в основном взаимодействием расположенных друг над лругом, как стопка монет, азотистых оснований. Существует несколько видов упорядоченных структур молекулы ДНК – В-форма (благоприятна для репликации, на один виток спирали приходится 10 пар оснований), А-форма (благоприятна для транскрипции, на один виток спирали приходится 11 пар оснований), С-форма (образует надмолекулярные структуры хроматина, присутствует у ряда вирусов, имеет 9,3 пары оснований на виток спирали), Z-форма (левая спираль, на один виток приходится 12 пар оснований, важна для кроссинговера). Известная также SBS-форма ДНК, в которой нет взаимозакрученности цепей в двойную спираль, такая форма, вероятно, обеспечивает легкость разделения цепей, что очень существенно при биосинтезе ДНК.
В клетках ДНК плотно «упакована», при этом третичная структура ДНК эукариотических клеток выражена в многократной суперспирализации молекулы, что осуществляется благодаря комплексам ДНК с белками. До 50% хроматина составляют белки-гистоны, на которые «накручена» нить ДНК, подобно катушке с нитками (нуклеосомы). Все гистоны в клетках подвергаются модификациям: ацетилированию, метилированию, фосфорилированию, поли-АДФ-рибозилированию, что изменяет их способность взаимодействовать с ДНК (механизм регуляции экспрессии генов). Второй уровень организации хромосом – это образование из нуклеосомной нити более толстых фибрилл, что обеспечивает уменьшение линейных размеров ДНК в 40-50 раз. Третий уровень организации хромосом представлен дальнейшей упаковкой фибрилл, образованием петель.
Митохондриальная ДНК представлена двухцепочечными, обычно кольцевыми молекулами. В одной митохондрии может содержаться от 2 до 10 молекул ДНК, обычно они находятся в матриксе. Все гены в митохондриальной ДНК расположены компактно, они кодируют рРНК, полный набор тРНК, ограниченное число, синтезируемых на полисомах в митохондриях (компоненты ферментативных комплексов внутренней мембраны митохондрий). Остальные субъединицы этих комплексов кодируются ядерными генами и синтезируются в цитоплазме.
Содержащиеся в клетке РНК различаются размером, составом, функциями: тРНК, мРНК (иРНК), рРНК, яРНК. Молекула РНК в отличие от ДНК состоит из одной полинуклеотидной цепи, которая образует в палиндромных участках двухспиральные "«пильки"» в которых азотистые основания образуют комплементарные пары: гуанин-цитозин, аденин-урацил.
Транспортные РНК – это самые мелкие молекулы РНК (75-90 нуклеотидов). Функция – транспорт аминокислоты в рибосомы и установка ее в определенные участки полипептидной цепи. Каждой из 20 аминокислот соответствует своя тРНК. Все тРНК построены по одному плану, укладываются в модель «клеверный лист» - образование максимального числа водородных связей между азотистыми основаниями. К 3’ или 2’-ОН-группе концевого аденозинового остатка присоединяется соответствующая аминокислота через свою СООН-группу, образуется аминоацил-тРНК. Антикодоновый участок тРНК распознает кодон данной аминокислоты в мРНК, что обеспечивает специфичность связывания тРНК с мРНК.
Рекомендуемые материалы
При связывании аминокислоты с тРНК образуется макроэргическая связь между кислородом гидроксила аминокислоты и фосфору АМФ, образуется аминоациладенилат. Затем остаток аминокислоты от аминоациладенилата отщепляется и перемещается на тРНК. Катализирует эти реакции аминоацилтРНК-синтетаза. Этот процесс называется рекогницией.
Матричная (информационная) РНК образуется в процессе транскрипции генов и несет точную копию генетической информации, закодированной в определенном участке ДНК (т.е. информацию о последовательности аминокислот в белках). В эукариотических клетках в процессе транскрпции сначала образуется про-мРНК, которые подвергаются процессингу. Каждой аминокислоте соответствует в мРНК определенная тройка (триплет) нуклеотидов, называемая кодоном этой аминокислоты. Таким образом, последовательность кодонов в цепи мРНК определяет последовательность аминокислот в белке. Вблизи 5’-конца мРНК за 3-15 нуклеотидов до первого кодона располагается последовательность нуклеотидов, необходимая для взаимодействия мРНК с рибосомой, она богата АГ. После этого участка в мРНК находится инициирующий кодон АУГ – сигнал начала синтеза белка, а вслед за ним располагаются кодоны, соответствующие аминокислотам. Сигналом окончания синтеза белка служит любой из кодонов УАА. УАГ, УГА. мРНК обладает сложной вторичной структурой, которая необходима для считывания знаков начала (инициация) и окончания (терминация) синтеза белка.
Рибосомная РНК – это основа, на которой располагаются белки, образующие рибосому (в цитоплазме, ядрышке, митохондриях). По размерам и молекулярной массе различают три вида рибосом. рРНК имеют V-образную форму, они образуют каркас, к которому прикрепляются белки, создавая плотно упакованный рибонуклеопротеин. Вторична структура рРНК создается за счет коротких двухспиральных участков молекулы – шпилек. При синтезе белка определенное число рибосом (от 3 до 100) прикрепляется к длинным нитевидным молекулам мРНК, образуя полисомы. Каждая рибосома в полисоме способна синтезировать полную полипептидную цепь. Образование полисом повышает эффективность использования мРНК, поскольку на ней может одновременно синтезироваться несколько идентичных полипептидов.
Различают три основных типа матричных биосинтезов в клетке:
1. Биосинтез ДНК (репликация ДНК) с использованием в качестве матрицы уже существующие молекулы ДНК.
2. Биосинтез РНК с использованием в качестве матрицы ДНК (транскрипция).
3. Биосинтез белков с использованием в качестве матрицы мРНК (трансляция).
В вирусах возможен биосинтез ДНК на матрице РНК и синтез РНК на матрице РНК.
Свойства генетического кода: триплетность, универсальность, неперекрываемость, вырожденность.
При нарушении структуры ДНК под действием химических, физических или биологических факторов возникают мутации. Уровень спонтанных мутаций составляет около 1 млн. в сутки, в основном, в результате мутагенного действия активных форм кислорода, образующихся в процессе метаболизма. Эти мутации, как правило, легко устраняются специальными клеточными ферментными системами. Индуцированные мутации также элиминируются системой репарации ДНК, при ее несостоятельности может возникнуть патология (злокачественная опухоль, наследственные заболевания). Поврежденные основания ДНК обнаруживаются ДНК-гликозидазами, которые расщепляют связь между поврежденным основанием и остатком дезоксирибозы. Далее работают ДНК-инсертаза (присоединяет к дезоксирибозе основание в соответствие с правилом комплементарности) или эндонуклеаза, экзонуклеаза, ДНК-полимераза и ДНК-лигаза.
Репликация ДНК происходит полуконсервативным способом: две исходные цепи отделяются друг от друга и каждая из них служит матрицей для синтеза новой цепи, каждая нова ядвойная пираль содержит таким образом одну старую и одну новую цепь. В основе образования новой цепи лежит принцип комплементарности оснований. В точке начала репликации цепи ДНК расходятся и образуются две репликативные вилки, которые движутся в противоположных направлениях. У эукариот синтез ДНК в репликативной вилке идет со скоростью 50 пар оснований в секунду, при этом репликация начинается одновременно во многих точках (боле 1000). Синтез ДНК в эукариотических клетках происходит в S-фазе клеточного цикла, которой предшествует G1-фаза, во время которой клетки получают сигнал о начале репликации и начинают синтез ферментов, необходимых для репликации ДНК.
В процессе репликации происходит расплетание двойной спирали ДНК с помощью фермента хеликазы. При разделении нитей ДНК происходит суперспирализация, связанная с тем, что из-за вращения нити ДНК спираль сжимается или раскручивается, и количество оборотов на единицу длины меняется. Такие сверхвитки перед репликативной вилкой мешают процессу репликации, поэтому в клетках существует специальные ферменты – топоизомеразы, расщепляющие связи в ДНК не путем гидролиза, а в результате временного переноса однонитевых концевых фрагментов ДНК на ферменнт без потери свободной энергии, что делает этот процесс легко обратимым.
Ферменты, катализирующие синтез новой цепи ДНК, назваются ДНК-полимеразами (описано 5 у эукариот, в том числе PCNA). Субстратами их являются дезоксинуклеозидтрифосфаты. Для копирования ДНК-полимеразе нужна одноцепочечная матрица ДНК, при этом ДНК-полимераза может только удлинять уже существующую нить (затравка, праймер), которая состоит из 2-10 нуклеотидов. Иными словами, ДНК-полимераза не может инициировать образование новой цепи, так как она не может соединить два свободных нуклеотида. Кстати, именно это отличает ее от РНК-полимеразы, обеспечивающей синтез РНК на матрице ДНК – она способна инициировать новые цепи. Интересно, что цепи ДНК инициируются при помощи РНК.
ДНК-полимераза присоединяет нуклеотиды к свободной концевой 3’-ОН-группе праймера, высвобождая при этом неорганический фосфат. Гидролиз последнего способствует протеканию реакции полимеризации. Включение нуклеотида в новую цепь ДНК сопровождается образованием водородных связей с матрицей, при этом происходит высвобождение энергии, что делает процесс термодинамически выгодным. Синтез ДНК всегда протекает в направлении 5’ – 3’ растущей цепи (полярность новой нити).
Короткие цепи ДНК, связанные с РНК-праймерами на цепи ДНК называются фрагментами Оказаки. Репликация ДНК идет в дух направлениях от одного инициирующего сайта (а точнее, от множества сайтов на хромосоме), 5’-концевая область одной цепи реплицируется полностью, но этого не происходит при синтезе противоположной цепи, потому что участвующий в образовании фрагментов Оказаки РНК-праймре расположен у 3’-конца матричной цепи. После удаления раймера эти концы оказываются нереплицированными и не существует механизма их восполнить, т.е. это означает, что с каждым клеточным делением хромосомы будут последовательно укорачиваться, что представляется с трудом. Решение проблемы заключается в том, что на концах хромосом эукариот находятся специальные повторяющиеся последовательности ДНК (теломерная ДНК): концы все еще не могут быть реплицированы при помощи ДНК-репликативного комплекса, но больше нет проблем с полнотой репликации хромосомы. Более того, в быстроделящихся клетках теломера добавляется для того, чтобы хромосома никогда не подвергалась риску укорочения. Теломеры хромосом состоят из коротких повторяющихся фрагментов (TTAGGG), фермент теломераза добавляет эти последовательности к 3’-концу предсуществующей теломерной ДНК и таким образом удлиняет ее. Теломераза – это очень интересный фермент: она является обратной транскреиптазой, т.е. синтезирует ДНК на матрице РНК, и эта матрица включена в структуру фермента. Например, теломераза обнаружена в эмбриональных клетках, которые постоянно и быстро делятся и непрерывное удлинение хромосом необходимо для компенсации их постоянного укорочения. В соматических клетках взрослого организма теломераза не обнаружена, т.е. в этих клетках уже есть теломерная ДНК, необходимая на время жизни клетки и ее потомства. Предполагают, что длина теломеры хромосомы определяет продолжительность жизни клетки и организма в целом. В клетках злокачественных опухолей, обладающих способностью к неконтролируемому делению, обнаружена активность теломеразы. Регуляция активности теломеразы и длины теломерных участков хромосом – один из подходов к лечению злокачетвенных заболеваний и предотвращению старения организма.
Матричный биосинтез белков начинается с транскрипции генов, результатом которой является образование мРНК, строительными блоками для нее являются нуклеотиды. В клетках существуют ДНК-зависимые РНК-полимеразы, которые синтезируют мРНК, при этом процесс схож с синтезом ДНК, рассмотренным выше. Элонгация цепи происходит в направлении 5’-3’. РНК-полимераза способна инициировать новые цепи и ей не нужен праймер.
Для данной живой клетки молекула ДНК бессмертна. Время же полужизни мРНК варьирует от 20 минут до нескольких часов. Для экспрессии гена (термин «экспрессия» означает, что ген работает и белок синтезируется) необходима постоянная транскрипция молекул мРНК. Можно сказать, что ген «штампует» копию за копией, а РНК-полимераза – это «штамповочная машина». По мере освобождения промотора (последовательности нуклеотидов ДНК, узнаваемые РНК-полимеразой) к нему могут присоединяться новые молекулы РНК-полимеразы, так что ген может транскрибироваться одновременно большим количеством молекул фермента.
После образования мРНК она подвергается посттранскрипционной доработке (процессингу) в ядре – отщеплению избыточных участков по концам нуклеотидной цепи, кэппинг, а также сплайсингу – удаление интронов и соединение экзонов.
Собственно синтез белка в рибосомах осуществляется в клетке в три этапа:
1. Инициация.
2. Элонгация.
3. Терминация.
В процессе инициации субъединица рибосомы соединяется с тРНК. Синтез белка в клетках эукариот всегда начинается с метионина. Затем присоединяется мРНК (АУГ), тогда как антикодон тРНК – УАЦ. После этого к комплексу присоединяется большая субъединица рибосомы. На этот процесс расходуется 1 молекула ГТФ и участвуют белки-факторы инициации. Наличие триплета однозначно определяет выбор тРНК, это принцип комплементарного спаривания. Долгое время оставалось непонятным, каким образом рибосомы инициируют трансляцию именно с первого АУГ, а не с любого другого АУГ в составе мРНК? Почему бы для инициации не использовать особый кодон? Эту ситуацию разрешил факт существования двух различных тРНК, специфичных для метионина. Обе тРНК обладают одним и тем же кодоном, но одна тРНК используется только для инициации, а другая – только для добавления метионина в процессе роста цепи (элонгации).
На этапе элонгации осуществляется собственно цикл работы рибосомы. ТРНК перебрасывается в большую субъединицу и рибосома по мРНК смещается на 1 триплет (транслокация). В малой субъединице образуется свободное место, на него приходит новая аминоацилтРНК. Таким образом, в малой субъединице связана аминоацилтРНК, в большой – пептидилтРНК. Далее пептидная цепь отщепляется и перебрасывается на аминоацилтРНК (транспептидация). ПептидилтРНК затем перебрасывается в большую субъединицу (транслокация), а тРНК – в цитопламзу. Малая субъединица рибосомы снова свободна.
В одном цикле работы рибосомы расходуется 2 молекулы ГТФ (1 – на связывание тРНК, 1 – на замыкание пептидной связи). В процессе элонгации участвуют белки-факторы элонгации – они являются G-белками, которые в комплексе с молекулой ГТФ связываются с рибосомами, обладают ГТФазной активностью. Гидролиз ГТФ обеспечивает конформационное изменение в этих белках, что вызывает их отсоединение от рибосомы.
Терминация синтеза полипептидной цепи осуществляется с помощью трех сигнальных триплетов – УАГ, УГА, УАА. При участии ферментов-факторов терминации пептидная цепь отщепляется и уходит в цитоплазму. В целом, на синтез белка уходит несколько часов (3 минуты –синтез небольшой пептидной цепи). Рибосома обеспечивает комплементарное спаривание тРНК и мРНК, катализирует синтез пептидных связей, освобождает вновь синтезированный белок.
Белок, синтезированный на рибосомах, подвергается дальнейшим модификациям – т.н. постатрансляционные модификации (например, фосфорилирование, присоединение углеводов, ограниченный протеолиз). Кроме того, развернутая нить белка должна тприобрести определенную вторичную, третичную структуры, а также транслоцировать в пределах клетки в другие органеллы, в том числе и преодолевая на своем пути мембраны органелл. Этот процесс обеспечивается белками теплового шока (БТШ), которые связываются с молекулами «раскрученных» полипептидов и сопровождают их в процессе транспорта в клетке и в процессе трансмембранного перехода (чаперонная активность).
Ферменты, участвующие в сворачивании (фолдинге) вновь синтезированных белков:
1. Протеин-дисульфидизомераза – перемещает дисульфидные связи в полипептидной цепи. Разрывая и вновь образуя дисульфидные связи между различными остатками цистеина, ПДИ способствует коррекции фолдинга.
2. Пептидилпронил-цис-транс-изомераза – катализирует изомеризацию пептидных связей пролина, что помогает белку принять правильную конфрмацию.Обнаружен класс белков циклофилинов, обладающих такой активностью, они связывают антибиотик-иммунодепрессант циклоспорин.
Существует группа смертельно опасных неврологических болезней, поражающих человека и животных (губчатая энцефалопатия, «коровье бешенство», болезнь Крюцфельда-Якоба и куру у человека). Раньше считалось, что эти болезни имеют вирусную природу, однако недавно было установлено, что инфекция обусловлена устойчивой к протеазам формой нормального белка (прионовый белок), обнаруженного в мозге. Вызывающий болезнь белок называется прионом (от proteinaceous infectious particle): нормальный и патологический белки одинаковы по первичной структуре, но имеют разные конформации, в результате чего патологический белок легко образует агрегаты, приводящие к образованию амилоидых бляшек в ткани мозга. Не существует биохимических механизмов, посредством которых патологический прионовый белок может воспроизводить сам себя, однако он может каким-то образом переводить нормальный белок мозга в аномальную форму (изменять его конформацию). Модели этого механизма подразумевают участие чаперона в раскручивании нормального прионового белка и его рефолдинг под влиянием инфекционного приона.
Прекращение матричных биосинтезов ведет к гибели клетки. На этом основано применение ингибиторов матричных биосинтезов для лечения инфекционных заболеваний, аутоиммунных процессов, злокачественных опухолей. К таким веществам относятся антибиотики и цитостатики. Они могут интеркалировать между основаниями ДНК или образовывать ковалентные сшивки между цепями ДНК, препятствуя репликации, блокировать центры связывания тРНК на рибосомах или соединяться с малой и большой субъединицами рибосом, тормозя их активность. В качестве лекарственных препаратов могут использоваться и последовательности ДНК, эти синтетические цепи нуклеотидов называются антисмысловыми, они способны тормозить транскрипцию и трансляцию в клетках-мишенях, поражая таким образом, например, клетки злокачественных опухолей.
Регуляция биосинтеза белков:
1. Известно, что ДНК связана с гистонами и негистоновыми белками хроматина. Гистоны, на которые накручена нить ДНК, тормозят транскрпцию ДНК, а при удалении гистонов ДНК становится доступной ферментам репликации и транскрипции. Негистоновые белки хроматина – это, как правило, собственно ферменты репликации и транскрипции (транскрипционные факторы).
2. Теория оперона: оперон – это отрезок ДНК, содержащий структурные гены определенных белков и регуляторные участки. С участком оперона, называемым промотором, связывается РНК-полимераза, при ее движении по оперону происходит транскипция структурных генов. В результате транскрипции гена-регулятора образуется мРНК и синтезируется белок-регулятор, который может присоединяться к оператору и блокировать транскрипцию структурных генов (мРНК при этом быстро разрушается). Если же в клетке присутствует субстрат белка-регулятора, то оператор свободен и транскрипция продолжается.
Гормональная регуляция биосинтеза белков осуществляется соматотропным гормоном, мужскими стероидными половыми гормонами, инсулином, гормонами щитовидной железы (стимулируют биосинтез белка), катехоламинами, глюкокортикостероидами, большими дозами гормонов щитовидной железы (ингибируют биосинтез белка).
Наиболее интенсивный синтез белков происходит в быстропролиферирующих тканях, а также в тканях, продуцирующих белки на экспорт (железы, печень). Деградация белков в клетке осуществляется в лизосомах и протеосомах. Один из механизмов деструкции белков опосредован активностью убиквитина.
В целом, экспрессия генов и синтез клеточных белков – тонко регулируемые процессы. При действии лигандов клеточных рецепторов происходит изменение экспрессии генов «немедленного раннего ответа», белки, кодируемые ими, регулируют экспрессию других генов, что обеспечивает долгосрочное изменение метаболизма клетки (например, для ее адаптации к измененным условиям внешней среды). Изменение активности транскрипционных факторов сопровождает все ключевые события в жизни клетки (пролиферация, дифференцировка, повреждение, репарация) и ее гибели (запрограммированная клеточная гибель, апоптоз).
Методы протеомики – новая область экспериментальной и клинической медицины, биологии, начала развиваться с 1995 года. Теоретическими предпосылками для развития такого рода направления стало осознание того, что несмотря на то, что в каждой клетке может быть только около 1000000 функционирующих генов, многочисленные реакции модификации могут увеличить число белков в клетке до 10-20 миллионов. Протеомика – это наука, занимающаяся инвентаризацией белков с помощью комбинированного использования методов двумерного электрофореза, масс-спектрометрического анализа молекулярной массы и последовательности разделенных электрофорезом белков с последующим анализом полученных результатов методами биоинформатики. Методами протеомики могут быть не только изучен белковый состав клеток (структурная протеомика), но и определен характер посттрансляционной модификации белков, выяснен характер взаимодействия различных белков или субъединиц в составе олигомерных комплексов (функциональная протеомика).
Достижения молекулярной биологии сделали возможным развитие генной инженерии. Основная цель генной инженерии – получение рекомбинантных молекул ДНК (конструирование химерных молекул ДНК и их клонирование), введение их в организм с целью получения новых свойств. Точки приложения генной инженерии – терапия наследственных заболеваний, приобретенных заболеваний, связанных с дефектами матричных синтезов, создание новых методов молекулярной диагностики.
В настоящее время существуют следующие методы генной терапии:
1. По типу клеток-мишеней:
- соматическая
- фетальная
2. По цели воздействия:
- позитивная (усиление экспрессии гена)
- негативная (снижение экспрессии гена)
3. По тактике введения рекомбинантного агента:
- ex vivo
- in vivo
- in situ
- in utero
Структура и функции, эффективность массовой коммуникации - лекция, которая пользуется популярностью у тех, кто читал эту лекцию.
4. По типу векторной системы:
- вирусные векторы
- невирусные векторы
- микроинъекции
- «генная пушка»
Агенты, используемые в генной терапии: ДНК, РНК (антисмысловые «ловушки» нуклеиновых кислот), протеины (одноцепочечные антитела, белки, кодируемые суицидными генами), ДНК-вакцины (молекулы ДНК). Химеропластика – это метод коррекции ДНК в клетке, химеропласты – это ДНК/РНК-химеры (25 нуклеотидов), которые претерпевают комплементарный сплайсинг с клеточной ДНК, изменяя таким образом ее функциональную активность.
