Часть 6

3.5.Свободные нуклеотиды и их производные. Динуклеотиды

Нуклеотиды не только входят в состав нуклеиновых кислот,но также в значительных количествах содержатся в клетках в свободном состоянии.

Нуклеотиды в своем составе могут содержать еще дополнительно один или два остатка фосфорной кислоты, т.е. встречаться в клетках в виде нуклеозид-5¹-дифосфатов (НДФ)  и нуклеозид-5¹-трифосфатов (НТФ). В названии каждого из этих соединений учитываются входящие в его состав  основание и пентоза.

                                                                          O                                    

      NH₂                                                            ÷ ê                                   АМФ (аденозин-

       ½                                                               -P-OH                             монофосфат)

                 N                                                       ê

N                                                                       OH

                                             5¢                          O      O

Рекомендуемые материалы

      N        N          O     H₂ -C-O-                  ú ê     ÷ ê                          АДФ (аденозин-

              1¢                                              -P-O~P-OH                  дифосфат)

    H              H    H         H                          ê         ê

                                                                OH     OH

         OH                OH                            O      O       O

                                                                ÷ ê     ÷ ê      ÷ ê                АТФ (аденозин-

                                                              -P-O~P-O ~P-OH          трифосфат)

                                                                             ï       ï         ï

                                                                             OH   OH     OH

Приводим строение рибонуклеозидфосфатов на примере семейства аденозина.

Знаком “~“ в формулах НТФ и НДФ обозначены высокоэнергетические фосфатные связи (макроэргические связи).

Для нормальной жизнедеятельности клетки важное значение имеют все НТФ, но среди них особое место занимает АТФ. Большая часть энергии. освобождающейся в процессе брожения, дыхания, фотосинтеза запасается в виде АТФ, который называют “биологически универсальной энергетической валютой”. АТФ во всех клетках выступает в качестве депо для хранения и переноса химической энергии (на молекулярном уровне). Он действует как связующее звено между процессами, производящими энергию и процессами, требующими затраты энергии. При этом его высокоэнергетические фосфатные группы непрерывно отщепляются и заменяются новыми.

В клетках содержатся мононуклеиды не обнаруживаемые в нуклеиновых кислотах. Среди них можно назвать никотинамидмононуклеотид, флавинмононуклеотид и кофермент А (см. витамины). Они также имеют важное значение в обмене.

        Среди динуклеотидов, имеющих важное значение в обмене веществ, в клетках содержатся  никотинамидадениндинуклеотид (НАД), никотинамидадениндинуклеотидфосфат (НАДФ), флавинадениндинуклеотид (ФАД). Все они содержат в качестве одного нуклеотида АМФ, а другим нуклеотидом у НАД и НАДФ служит никотинамидмононуклеотид, у ФАД  -  флавинмононуклеотид. Во всех трех динуклеотидах мононуклеотидные единицы связаны между собой ангидридной связью; их фосфатные группы образуют 5¹, 5¹-пирофосфатный мостик. Напоминаем, что в нуклеиновых кислотах нуклеотиды связаны между собой 3¹¾®5¹-фосфодиэфирной связью, Для примера приводим химическую формулу НАД:

                                  O                                                                                                                                  NH₂

                           ú ç                                                                                                              ê 

                            C-NH₂                                                                                       N                N                   

                                                          O              O                                                          

                  +                       5¢           ÷ ç             ÷ ç                5¢                              N

                  N         O     H₂C     O      P       O     P      O        CH₂         O                            N              

                                                                       ê                   ê

              H          H   H        H           ОН           ОН              H           H    H           H

                   OH        OH                                                                          OH        OH

                 Никотинамидмононуклеотид                                   Аденозинмонофосфат

Строение и биологическая роль мононуклеотидов и динуклеотидов более подробно описаны в разделах ферменты и витамины.

ГЛАВА 4.   ФЕРМЕНТЫ

4.1.Общее понятие о ферментах. Иммобилизованные ферменты

Ферменты, или  энзимы - это биологические катализаторы, образующиеся и функционирующие во всех живых организмах. Из приведенных названий в литературе на русском языке принят термин “ферменты”, а процессы, происходящие с участием этих катализаторов - ферментативными.

Вещество, превращение которого  катализирует фермент, получило название  с у б с т р а т.

Ферменты являются важнейшими компонентами клетки, они тесным образом связаны с разнообразными процессами  жизнедеятельности, их роль как биокатализаторов биохимических превращений подобна роли катализаторов в других химических реакциях. По определению И.П.Павлова “ферменты есть... первый акт жизнедеятельности... они... возбудители всех химических превращений... основной пункт, центр тяжести физиолого-химического знания”.

Ферменты идеально приспособлены для работы в живой клетке, но после выделения из клетки они не теряют свои каталитические  свойства. На этом основано практическое применение ферментов в химической, пищевой, легкой и фармацевтической промышленности.

Принцип связывания ферментов с различными структурами клетки в настоящее время используют в биотехнологии. При этом ферменты прикрепляют (иммобилизуют) к поверхности какого-либо твердого носителя (целлюлоза и ее производные, полиакриламид, пористое стекло, нейлон, алюмосиликаты и др.), что позволяет не только сохранить их каталитические свойства, но и повысить стабильность. Такие ферменты получили название  и м м о б и л и з о в а н н ы х.

Иммобилизованные ферменты обладают рядом преимуществ по сравнению с природными предшественниками: во-первых, их можно легко отделить от реакционной среды и использовать повторно; во-вторых, процесс можно вести непрерывно (в проточных колоннах) и, изменяя скорость потока, регулировать скорость каталитической реакции и выход продукта. Иммобилизованные ферменты успешно используют для получения глюкозы из крахмала, получения глюко-фруктозного сиропа и в ряде других крупнотоннажных производств.

4.2. Химическая природа и строение ферментов. Активный центр ферментов

Установлено, что все известные в настоящее время ферменты представляют собой белки.

Ферменты обладают теми же физико-химическими свойствами, что и белки. Их молекулярная масса колеблется от десятков тысяч до нескольких миллионов. По форме молекул ферменты относятся к глобулярным белкам.

Все ферменты подразделяют на две большие группы:  о д н о к о м п о н е н т н ы е   и   д в у х к о м п о н е н т н ы е. К первой группе относят ферменты, состоящие только из белка, а ко второй  -  состоящие из белка и связанной с ним небелковой части (активная группа или кофактор). Белковая часть двухкомпонентного фермента носит название   а п о ф е р м е н т,  небелковая часть  - п р о с т е т и ч е с к а я   группа  или кофермент, а молекула в целом  -  х о л о ф е р м е н т.

Прочность связи между белковой и небелковой частями у различных ферментов различна. В связи с этим небелковую часть, сравнительно прочно связанную с апоферментом называют   п р о с т е т и ч е с к а я   группа, а небелковую часть, сравнительно легко удаляющуюся через полупроницаемую мембрану при диализе  -  к о ф е р м е н т.

В качестве кофакторов двухкомпонентных ферментов может функционировать значительное число органических и неорганических веществ. Из органических соединений функцию кофакторов выполняют многие витамины, нуклеотиды (ФМН и др.), динуклеотиды (НАД, НАДФ, ФАД), железопорфирины (гем и гематин), липоевая кислота,  и другие соединения.

Из неорганических веществ функцию кофакторов выполняют ионы различных металлов: цинка, меди, железа, молибдена, никеля, марганца, магния, кальция и др. В одних ферментах металлы бывают довольно прочно связаны с белком и не отделяются от него в процессе очистки. В других ферментах металл непрочно связан с белком и легко отделяется от него в процессе очистки.

А к т и в н ы й  ц е н т р. Известно, что размеры ферментов намного превышают размеры субстратов или функциональных групп, на которые они действуют. Это дало основание предполагать, что субстрат соединяется не со всей молекулой фермента, а с отдельным его  участком, получившим название  “а к т и в н ы й  ц е н т р”, т.е. та область фермента, в которой происходит связывание и превращение субстрата.

Активный центр образуется радикалами аминокислотных остатков полипептидной цепи при формировании ее третичной структуры; у двухкопонентных ферментов в состав активного центра входят и некоторые группировки небелковой части. Достройка активного центра двухкомпонентных ферментов происходит после взаимодействия апофермента с небелковой частью. Нарушение третичной структуры фермента под влиянием различных факторов приводит к дефомации активного центра и изменению ферментативной активности.

Наиболее часто в состав активных центров ферментов входят радикалы серина, гистидина, треонина, цистеина, аргинина, аспарагиновой и глутаминовой кислот.

Активный центр функционально неоднороден; в нем условно выделяют “каталитически активный” участок, где происходит превра-щение субстрата (расщепление или синтез связи), и так называемый контактный или “якорный” участок, который обеспечивает связывание субстрата с ферментом.

Рис 4.1   Модель молекулы фермента

А - третичная структура молекулы;  Б - силуэт молекулы с активным центром (в рамке).

В молекуле фермента может присутствовать  а л л о с т е р и ч е с к и й   центр, представляющий собой участок молекулы, присоединение к которому определенных веществ приводит к изменению третичной структуры  молекулы фермента. В результате этого происходит изменение конфигурации активного центра, сопровождающееся либо увеличением, либо снижением каталитической активности фермента. Это явление лежит в основе так называемой аллостерической регуляции активности ферментов. Ферменты, активность которых регулируется веществами, присоединяющимися к аллостерическому центру, получили название    а л л о с т е р и ч е с к и х  ферментов.

4.3  Механизм ферментативного катализа

Химическая реакция имеет определенный “энергетический барьер” и может произойти только в том случае, если реагенты (реагирующие молекулы) обладают запасом энергии, достаточным для достижения ими вершины этого барьера и перехода в промежуточное состояние, называемое  а к т и в и р о в а н н ы м    комплексом или               п е р е х о д н ы м  с о с т о я н и е м. В переходном состоянии возможно одновременное образование новых и разрыв старых химических связей.

Активация молекул может происходить при повышении температуры, в результате поглощения ими лучистой энергии, при столкновении с другими возбужденными молекулами или атомами,передающими им часть своей энергии. Количество энергии, необходимое для достижения при данной температуре всеми молекулами  одного моля вещества переходного состояния, соответ-ствующего вершине энергетического барьера, называется  э н е р г и е й   а к т и в а ц и и.  Иначе, энергия активации представляет собой  “энергетический барьер”, который нужно преодолеть для того, чтобы произошла реакция.

В присутствии катализатора понижается энергия активации . Причем фермент снижает энергию активации значительно сильнее, чем неорганический катализатор.

Согласно теории Михаэлиса-Ментен фермент (Е) соединяется со своим субстратом (S), образуя нестойкий промежуточный комплекс (ES), который в конце реакции распадается с освобождением фермента и продуктов реакции. Поэтому всю последовательность каталитического ферментативного  процесса можно представить следующим образом:

                                    E  +  S                      ES                        EX                       EP                        E  +  P,

где ЕХ  -  истинный активированный комплекс (переходное состояние); ЕР  -  комплекс фермента с продуктом.

В самой общей форме можно сказать, что молекула субстрата, после связывания с активным центром фермента, поляризуется, электроны в ней перераспределяются, расположение электрических зарядов изменяется, связи деформируются и все это приводит к повышению ее активности.

4.4. Обратимость действия ферментов

Реакции, катализируемые многими ферментами обратимы, т.е. один и тот же фермент в зависимости от определенных условий может катализировать реакцию в обоих направлениях. В 1884г.

Обратимость действия ферментов бесспорно доказана вне организма. Однако в живой клетке большинство ферментативных синтезов (см. обмен веществ) происходит под действием других ферментов, а не тех, которые катализируют расщепление того или иного соединения и, следовательно, не благодаря обратимости действия ферментов. Это, по-видимому, связано с тем, что в живой клетке в большинстве случаев происходит удаление продуктов реакции и, кроме того, реакции синтеза и соответствующие им реакции распада часто локализованы в разных участках, или отсеках (компартментах) клетки. Такая компартментализация гарантирует независимое протекание процессов синтеза и распада и обеспечивает благоприятные энегргетические условия для них.

4.5. Специфичность ферментов

Под специфичностью ферментов понимают способность каждого из них катализировать одну или несколько близких по природе хими-ческих реакций. Это одно из важнейших биологических явлений, без которого невозможен упорядоченный обмен веществ в живом организме, а следовательно, и сама жизнь.

Исследуя природу ферментативного катализа Э.Фишер в 1890-х годах пришел к выводу, что специфичность ферментов можно уподобить соответствию между “ключом и замком”. При этом под-разумевается, что активный центр фермента имеет жесткую структуру, подобно замку. Молекула субстрата должна иметь комплементарную структуру, чтобы входить в активный центр, подобно ключу (рис 4.2). Представление Э.Фишера об активном центре фермента, как жесткой структуре, не подвергалось сомнению в течение полустолетия.

По мере изучения механизма действия ферментов был выявлен ряд данных, которые нельзя согласовать с теорией “ключа и замка”. Например, фермент не может атаковать (подвергнуть превращению) молекулы веществ, обладающие меньшим или большим размером по сравнению с субстратом, но имеющие такие же группы для взаимодействия с ферментом, что и субстрат. Следует отметить, что в ряде случаев такие молекулы связываются с контактным участком активного центра, но при этом превращение субстрата не происходит.

Специфичность у разных ферментов выражена в неодинаковой степени. Различают следующие типы специфичности.

1. А б с о л ю т н а я   с п е ц и ф и ч н о с т ь. При  этом типе специфичности фермент катализирует превращение только одного субстрата. Фермент каталаза катализирует расщепление пероксида водорода на воду и кислород; ее действие ограничивается только этим субстратом.

Рис 4.2. Схема связывания фермента и субстрата согласно теории “ключа и замка”

Обозначение:     E- фермент;     S-субстрат;  Р - продукты;  ES- комплекс  фермент-субстрат; ЕХ - истинный активированный комплекс; А - активный центр фермента.

2. Г р у п п о в а я   с п е ц и ф и ч н о с т ь. Основным признаком для ферментов этого типа специфичности служит характер разрушаемой или создаваемой связи в близких по строению  группах веществ. К ферментам с групповой специфичностью относятся липазы, катализирующие гидролиз сложных эфиров глицерина и карбоновых кислот; фосфатазы, действующие на эфиры фосфорной кислоты; пептидгидролазы, катализирующие гидролиз пептидных связей в белках и пептидах и др.

3. С т е р е о х и м и ч е с к а я   с п е ц и ф и ч н о с т ь. Ферменты этого типа специфичности действуют на определенный изомер одного и того же вещества: D-   или  L-,  a-  или  b- , транс-  или  цис-  .  Пептидгидролазы действуют только на пептиды, образованные аминокислотами  L-ряда.

4.6. Кинетика ферментативных реакций

Химическая кинетика  -  это учение о скоростях и механизмах хи-мических реакций. Ферментативная кинетика изучает закономерности влияния химической природы реагирующих веществ (фермента, субстратов) и условий их взаимодействия (концентрация фермента, концентрация субстратов или ингибиторов) на скорость ферментативных реакций.

4.6.1. Измерение  скорости ферментативных реакций

Мерой скорости ферментативной реакции служит количество субстрата, подвергшегося превращению в единицу времени, или количество образовавшегося продукта.

4.6.2. Единицы активности ферментов

Для выражения каталитической активности Комиссией по ферментам Международного биохимического союза (1961 г.) была рекомендована стандартная единица, обозначенная на русском языке - Е, а на английском - U.

С т а н д а р т н а я   е д и н и ц а  -  это такое количество фермента, которое при заданных условиях катализирует превращение одного микромоля субстрата за одну минуту.

В 1972 г. Комиссия по ферментам Международного биохимического союза предложила выражать активность ферментов в  к а т а л а х. Катал (символ  -  кат  -  это такое количество фермента, которое способно превращать один моль субстрата за одну секунду (при оптимальных условиях).

К производным величинам, характеризующим активность ферментов, относят удельную каталитическую активность ферментов, концентрацию фермента в растворе и другие. Удельную каталитическую активность фермента или ферментативного препарата выражают в каталах на 1 кг белка (кат·кг^-1) или чаще в мккат на 1мг белка. Концентрацию фермента в растворе выражают в каталах на 1 литр (кат·л^-1) или в других, кратных этому значению величинах.

4.6.3. Влияние концентрации субстрата на скорость ферментативной реакции

Ферментативные реакции, в отличие от неферментативных, обладают очень важной особенностью - насыщения фермента субстратом. Эта особенность проявляется в том, что при постоянной концентрации фермента скорость реакции имеет характерную зависимость от концентрации субстрата. При низких концентрациях субстрата скорость реакции пропорциональна концентрации субстрата и по отношению к нему - это реакция первого порядка. С увеличением концентрации субстрата приращение скорости с каждым разом уменьшается и, наконец, она становится практически независимой от концентрации субстрата. В этих условиях реакция по отношению к субстрату - нулевого порядка, а весь фермент полностью насыщен субстратом и не может функционировать быстрее. Скорость ферментативной реакции при полном насыщении фермента  субстратом называется  м а к с и м а л ь н о й   с к о р о с т ь ю.

                                              V_max · [S ]                                               

                                 V  =                                          

                                                 К_m +  [S ]                                          

Это окончательное уравнение, выведенное для односубстратной реакции, называют  у р а в н е н и е м    М и х а э л и с а - М е н т е н. Данное уравнение позволяет легко измерять максимальную скорость из экспериментальных данных, полученных при любой фиксированной концентрации фермента.  График зависимости скорости ферментативной реакции от концентрации субстрата представляет собой гиперболу  (рис. 4.3).

   V_max                                                                                        Рис. 4.3. Зависимость

                                                                            скорости реакции

                                                                                                             катализируемой

                                                                    ферментом, от

 1/2 V_max                                                              концентрации

                                                                           субстрата.

                                                                              [S]                          К _m  -  константа Михаэлиса

                           K_m                                     

4.6.4  Влияние концентрации фермента на скорость                                           ферментативной реакции

При высокой концентрации субстрата и при постоянстве других факторов скорость ферментативной реакции зависит от концентрации фермента. При построении графика эта зависимость будет линейной (рис. 4.4).

Рис. 4.  Влияние концентрации фермента на скорость реакции: V - скорость реакции;  [E] - концентрация фермента.

4.6.5  Влияние температуры на скорость ферментативной реакции

Важным фактором, от которого зависит скорость ферментативной реакции (равно каталитическая активность фермента) является температура, влияние которой показано на рис