Кандидатская диссертация: Индикация факторов вирулентности энтеробактерий, дифференциальная диагностика эшерихиоза птиц

Актуальность темы. При содержании на ограниченных площадях, искусственный микроклимат, поточная система выращивания птицы обусловливают развитие и распространение инфекционных болезней, в том числе, вызываемых патогенными энтеробактериями (Бессарабов Б.Ф., 1980; Стрельников А.П., 1987; Тугаринов О.А., 1987; Шустер Б.Ю., 1987; Каврук Л.С., 1994; Сидоров М.А. и соавт., 1995; Ленев С.В., 1996; Смирнова Л.И., 1996; Капустин А.В., 2001; Вершняк Т.В., 2003; Артемьева Т.Н., 2004; Салаутин В.В., 2004; Степаненко И.П., 2005; Крупальник В.Л., 2005; Коровин В.И., 2005; Хатько Н.Ф., 2005; Гусев В.В., 2006; Бедоева З.М., 2006; Павлова И.Б. и соавт., 2007; Субботин В.В., 2007; Панасенко А.С., 2008; Рождественская Т.Н., 2011; Кононенко А.Б. и соавт., 2011; Маннапова Р.Т., 2012; Пименов Н.В., 2012; Костенко Ю.Г. и соавт., 2012; Алиев А.С., Алиева А.К., 2013; Ирза В.Н., 2014; Панин А.Н., Куликовский А.В., 2014; Collins M.D., 2001; Krysta H.R., 2006). В структуре инфекционных болезней птиц в 2012 г. заболеваемость эшерихиозом составила 53,9 %, падеж – 92,0 %; в 2013 г. массовая доля сальмонеллеза – 12,0 %, эшерихиоза – 40,0 % (Венгеренко Л.А., 2012; Фисинин В. И., 2013; Бобылева Г.А., 2013; Джавадов Э.Д., 2014). При персистенции микроорганизмов в организме бактерионосителей может происходить контаминация пищевого сырья энтеробактериями, в том числе E.coli О157:Н7, циркулирующими в птицеводческих хозяйствах и выделенных из мяса бройлеров (Бондаренко В.М., Шаманова М.А., 2004; Степаншин Ю.Г. и соавт., 2005; Doule M.O., Schoeni J.L., 1987; Bitzan M., Ludwig K., 1993; Thamm B., 2000). Распространенность энтерогеморрагических штаммов среди поголовья кур и индеек составила 9,3 % из общего числа изолятов (Онищенко И.С., 2008). При изучении видового состава изолятов, циркулирующих среди поголовья птицы, наряду с сальмонеллами и патогенными эшерихиями, выделены бактерии K.pneumonia, P.vulgaris, Y.pseudotuberculosis, C.jejuni, P.aeruginosa (Куликовский А.В., 1998; Ленченко Е.М., 2000, 2014; Борисенкова А.Н., 2008; Вашин И., Стоянчев Т., 2008; Шуляк Б.Ф., 2008; Ольховик О.П., 2009; Скляров О.Д. и соавт., 2010; Козак С.С., 2014; Sukumaran S.K., 2003; Westermark L., 2013). При инфицировании восприимчивых видов реализация патогенных свойств энтеробактерий обеспечивается факторами вирулентности, кодируемыми хромосомными, плазмидными генами и интегрированными в хромосому бактериофагами (Светоч Э.А., 1992; Молофеева Н.И., 2004; Орлова К.А., 2004; Пирожков М.К., 2002, 2011; Letarov A.V., 2010; Goodridge L.D., 2011; Sulakvelidze A., 2011; Pasmans F., 2012; Berghaus R. D., 2013). Для оптимизации схемы бактериологической диагностики, характеризующейся трудоемкостью, продолжительностью, ретроспективностью идентификации и дифференциации эпизоотических штаммов, целесообразно изучение этиологической значимости факторов вирулентности в патогенезе и иммуногенезе инфекционного процесса при диссеминации микроорганизмов в тканях и органах птиц, что и определило актуальность темы диссертационной работы.
Цель работы: изучить видовой состав и патогенные свойства изолятов, выделенных из репрезентативной выборки птицеводческих объектов, динамику развития патологических процессов при диссеминации в ткани и органы птиц для совершенствования индикации факторов вирулентности энтеробактерий и дифференциальной диагностики эшерихиоза птиц.
Задачи исследований: - изучить этиологическую структуру болезней органов пищеварения птиц, вызываемых патогенными энтеробактериями; - изучить факторы вирулентности и фенотипические признаки, связанные с плазмидами вирулентности энтеробактерий, выделенных из репрезентативной выборки птицеводческих объектов; - апробировать и изыскать эффективные дифференциально-диагностические среды, лабораторные модели, молекулярно-генетические экспресс-методы идентификации ДНК патогенных бактерий; - изучить дифференциально-диагностические признаки патогенных энтеробактерий при диссеминации в ткани и органы птиц; - изучить влияние токсигенных энтеробактерий на динамику развития патологических процессов в тканях и органах птиц.
Научная новизна. Научно обоснована и экспериментально подтверждена эффективность применения тест-системы «Ампли-Сенс Эшерихиозы-FL», основанной на методе полимеразной цепной реакции, что позволяет в составе комплекса видовой идентификации и дифференциации сходных видов энтеробактерий идентифицировать ДНК патогенных E.coli в течение 3 ч, с чувствительностью 250 бактериальных клеток в исследуемом образце, корреляцией результатов исследований с применением лабораторных моделей (r=0,89). При экстравазации витального красителя коэффициент проницаемости кровеносных сосудов составляет 1,02±0,09–1,37±0,17, термостабильные токсины продуцировали 75,0 % культур микроорганизмов, выделенных из репрезентативной выборки птицеводческих объектов. При трансовариальном и интраназальном заражении птиц диссеминация энтеробактерий в ткани и органы наблюдается через 24–48 ч. Динамика развития патологических процессов при действии цитотоксинов E.coli О157:Н7 характеризуется дифференциальными признаками, обусловленными дистрофическими и некротическими процессами гепатобиллиарной системы и нефротоксическим синдромом, проявляющимся застойным геморрагическим инфарктом, некрозом эпителия канальцев нефронов почек птиц.
Практическая значимость работы. На основе апробации и подборе эффективных диагностических сред, тест-систем для идентификации патогенных бактерий разработаны «Методические рекомендации по индикации энтеробактерий, циркулирующих в птицеводческих хозяйствах», утвержденные академиком-секретарем отделения ветеринарной медицины Россельхозакадемии Смирновым А.М. (протокол № 7 от «16» октября 2013 г.).
Апробация материалов диссертации. Основные результаты диссертационной работы доложены и одобрены на заседаниях кафедры «Инфекционные и паразитарные болезни», «Ветеринарная медицина» ФГБОУ ВПО «МГУПП» (М., 2011–2014 гг.); на IX Международной научной конференции студентов и молодых ученых «Живые системы и биологическая безопасность населения» (М., 2011); на Общеуниверситетской научной конференции молодых ученых и специалистов «День науки IV» (М., 2014).
Основные положения, выносимые на защиту: - результаты изучения этиологической структуры болезней органов пищеварения птиц, вызываемых патогенными энтеробактериями; - результаты изучения факторов вирулентности и фенотипических признаков, связанных с плазмидами вирулентности энтеробактерий, выделенных из репрезентативной выборки птицеводческих объектов; - результаты изучения дифференциально-диагностических признаков патогенных энтеробактерий при диссеминации в ткани и органы птиц, на основе апробации и подборе эффективных питательных сред, лабораторных моделей, молекулярно-генетических экспресс-методов идентификации ДНК патогенных бактерий; - результаты изучения влияния токсигенных энтеробактерий на динамику развития патологических процессов для усовершенствования схемы видовой идентификации эпизоотических штаммов в составе комплекса дифференциальной диагностики эшерихиоза птиц.
Публикация результатов исследований. По материалам диссертационной работы опубликовано 5 научных статей, в том числе 3 в журналах, рекомендованных ВАК РФ.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследований, результатов собственных исследований, обсуждения результатов, выводов, библиографии, 2 приложений. Работа изложена на 160 страницах компьютерного текста, содержит 27 таблиц, 30 рисунков. Библиографический список включает 218 источников, из них 98 иностранных авторов.