Диссертация (Реакция глии спинного мозга мыши в условиях космического полёта и опорной разгрузки задних конечностей), страница 8

К тому же, имеются сведенияо сдвигах в биосинтезе белка в мионевральных синапсах в условиях ОРЗК[Тяпкина др., 2013].Таким образом, есть причины предполагать, что опорная имеханическая разгрузка в ответ на реальную и моделируемую невесомостьприводит к изменениям на тканевом, клеточном и молекулярно-генетическомуровнях в нервной ткани и является одним из ключевых факторов развитиягипогравитационногодвигательногосиндрома.Участиеглиивегопатогенезе практически не изучено, углубленное исследование этого вопросакрайне актуально для дальнейшей разработки мер профилактики негативныхреакций в условиях дальних космических полѐтов.403. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ3.1 Экспериментальные группыЭксперименты проведены на 28 половозрелых мышах инбреднойлинии C57/bl6, самцах весом 25±3 г, возраст которых к началу исследованиясоставлял 19–20 нед.

(табл. 1). Животные были свободны от патогенноймикрофлоры. Во всех экспериментах мышей содержали группами по 3 особив клетке.Таблица 2. Экспериментальные группы животныхГруппаХарактер экспериментаИнтактнаяCтандартные условия виварияОпорная разгрузкаКруглосуточное антиортостатическоезадних конечностейположение животных в течение(ОРЗК)30 сутокПолѐтнаяКонтрольнаяполѐтной группы30-суточный космический полѐт набиоспутнике БИОН-М1Количествомышей88330 суток содержания на Земле вусловиях, максимально моделирующих3среду обитания на биоспутнике30-суточный космический полѐт наВосстановленнаябиоспутнике БИОН-М1 с 7-суточным3периодом реадаптации на Земле30 суток содержания на Земле вКонтрольнаяусловиях, максимально моделирующихвосстановленнойсреду обитания на биоспутникегруппы+7 суток реадаптации на Земле в3стандартных условиях виварияМодель ОРЗК воспроизводили стандартным методом [Morey-Holton,Globus, 2002], при этом животное, максимально вытянувшись, не доставалозадними конечностями настил и могло свободно перемещаться по клетке на41передних конечностях.

Животных интактной группы и ОРЗК содержали состандартным суточным режимом и свободным доступом к воде и корму.Спинной мозг мышей полѐтной и восстановленной групп, а также ихконтроли были предоставлены ГНЦ РФ – ИМБП РАН из полѐтногоэксперимента на борту биоспутника БИОН-М1 [Андреев-Андриевский и др.,2014]. Эксперименты на животных проводили на основании решенияКомиссии по биомедицинской этике ГНЦ РФ – ИМБП РАН (протокол № 319от 4.04.2013 г.), одобряющей исследования по проекту БИОН-М1. Всепроцедурысживотнымипроводиливсоответствиисправилами,рекомендованными Физиологической секцией Российского национальногокомитета по биологической этике [Генин и др., 2001].3.2 Приготовление гистологических препаратовНа 30 сутки эксперимента мышей групп ОРЗК и интактных мышейнаркотизировали путѐм внутрибрюшинной инъекции хлоралгидрата (Sigma)(80 мг/мл, 0,4 мл на 100 г), после чего их транскардиально перфузировали 4%раствором параформальдегида (4°С).

Забор проводили тотчас, не допуская ихкасания задними конечностями пола клетки или иных поверхностей.Животных полѐтной, контрольной полѐтной, восстановленной и контрольнойвосстановленной групп забивали методом цервикальной дислокации.Выделялишейныйпроцессировалиидляпоясничныйотделспинногоиммунофлуоресцентогомозга,которыйисследования.Длягистологического исследования спинной мозг мышей фиксировали врастворе параформальдегида в течение 24-х часов. В целях криопротекциификсированную ткань насыщали 30% раствором сахарозы и передзамораживанием помещали в заливочную среду TBS (Triangle BiomedicalScience, Durham, NC). Поперечные срезы (20μm) готовили на криостате HM560 (Thermo Scientific) при температуре -25°С с последующим хранением в30% растворе сахарозы при температуре 4°С.423.3 Иммуногистохимические методыИммунофлуоресцентные реакции проводили на поперечных свободноплавающих срезах шейного и поясничного отделов спинного мозга.

Срезыпромывали в PBS с 1% Triton X-100 в течение 5 минут 3 раза,неспецифические места связывания блокировали в PBS, содержащим 1%Тритон X-100 и 5% сыворотку лошади, в течение 1 часа при комнатнойтемпературе. Астроциты выявляли с помощью иммуногистохимическихреакций с антителами против глиального фибриллярного кислого белка(GFAP) (Santa Cruz, 1:250), белка S100B (Santa Cruz; 1:1200), нейроны –бета-тубулина 3 (βTubIII), миелинобразующие клетки – белка миелинаолигодендроцитов (OSP) (Santa Cruz, 1:100), транскрипционного фактораолигодендроцитов 2 (Olig2) (Santa Cruz, 1:200), белка миелина P0 (Abcam,1:100), белка Krox24 (R&D Systems, 1:30), Krox20 (Covance,1:50) и Сx47(Santa Cruz,1:150). Клетки микроглии выявляли при помощи антител противIba1(Biocare,1:200)иHoxb8(Abcam,1:100).Первыйэтапиммунофлуоресцентной реакции проводили при температуре 4°С в течении12 ч.

После промывки в PBS срезы инкубировали с вторичными антителами,в качестве которых применяли ослиные Ig, конъюгированые с флуорохромомAlexa 488 (Invitrogen, 1:200), Alexa 555 (Invitrogen, 1:200) и Alexa 647(Invitrogen, 1:200). Для визуализации ядер клеток срезы дополнительноокрашивали в течение 10 минут при комнатной температуре растворомпропидиума йодида (краситель DAPI, 10 мкг/мл в PBS, Sigma). Анализпоперечных срезов шейного и поясничного утолщений спинного мозгапроводилиспомощьюконфокальногосканирующегомикроскопаLSM 510 META (Carl Zeiss, Germany).3.4 МорфометрияДляследующиеиммуногистохимическогозоны(рис.1):анализавентральныеглиирогабыли(ventralвыбраныhorn,VH),кортикоспинальный тракт в дорсальных канатиках (corticospinal tract, CST),43вентральные канатики (ventral funiculus, VF), зона центрального канала(сentral channel, СС), зона вхождения дорсальных корешков (dorsal root entryzone, DREZ). Во всех этих зонах иммунопозитивные клетки подсчитывали вквадрате площадью 0,05 мм2 в каждом из 6 срезов с интервалом 0,5 мкм.

Всимметричных зонах спинного мозга, таких как VH, VF, DREZ, подсчѐтклеток производили на обеих сторонах среза спинного мозга.Рис. 1. Области подсчѐта клеток глии выделены квадратами: VF –вентральный канатик, VH – вентральный рог, CST – кортикоспинальныйтракт, DREZ – зона вхождения дорсальных корешков, CC – центральныйканал.Цифровые изображения срезов спинного мозга анализировали спомощью программы ImageJ 1.46. При подсчѐте количества клетокпринадлежность иммунопозитивных структур конкретной клетке определялипо локализации еѐ ядра, выявляемого при помощи DAPI.В качестве показателя уровня экспрессии белков GFAP, S100B и OSPвклеткахиспользоваливеличинуплотностифлуоресценциисоответствующих маркеров на цифровом изображении среза.

Плотностьфлуоресценции в процентах вычисляли как отношение суммы ненулевыхпикселей в снимке данного канала флуоресценции к площади изображения впикселях. Изображения получали при стандартизированных значенияхпинхола, мощности лазеров и скорости сканирования.443.5 Статистическая обработка результатовСтатистическую обработку полученных результатов проводили сиспользованием пакета программ Origin8.0 Pro. Достоверность различийопределяли с помощью U-критерия Манна-Уитни-Вилкоксона. Для всехстатистических данных уровень достоверности был принят меньше 0,05 (p≤0,05).454.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ4.1. Поясничный отдел спинного мозгаАстроцитыGFAP-иммунопозитивные клетки. Для анализа астроцитов использовалимаркеры GFAP и S100B (рис. 2, 3). На 30 сутки эксперимента у мышейполѐтной группы количество GFAP+-астроцитов в VH уменьшается. В другихзонах серого и белого вещества достоверные сдвиги по этому показателю незарегистрированы. На модели ОРЗК показано, что сдвиги в количествеGFAP+-астроцитовразнонаправленывразличныхзонахспинногомозга (рис.

4).Рис. 2. Экспрессия белков GFAP (красный) и S100B (желтый) в интактномспинном мозге (А, В) и на 30 сутки от начала опорной разгрузки заднихконечностей (ОРЗК) (Б, Г) в зонах: вентральных канатиков (А, Б) икортикоспинального тракта в дорсальных канатиках (В, Г). Ядравизуализированы с DAPI (синий). Масштаб 100 мкм.46В сером веществе (VH) количество GFAP+-клеток достоверно снижается содинаковой выраженностью как в условиях космического полѐта, так и приОРЗК. Это свидетельствует об однонаправленных сдвигах впопуляцииGFAP+-астроцитов, происходящих в спинном мозге мышей при реальнойгипогравитации и симуляции еѐ на Земле.S100B-иммунопозитивные клетки. Количество S100B+-клеток в полѐтнойгруппе устойчиво возрастает как в сером (СС), так и в белом (CST) веществе.Следует отметить, что в этих зонах различия в количестве S100B+-клетокпроявляются в большей мере, чем в случае GFAP+-клеток.

Это может бытьсвязано с тем, что внутриклеточные сигнальные пути с участием белка S100Bнаиболее чувствительны к действию факторов космического полѐта (стресс,перегрузки,невесомость).Можнотакжепредполагать,существенные сдвиги в количестве S100B+-клеток у мышейчтоболееполѐтнойгруппы связаны с более выраженной гетерогенностью популяции S100B +клеток, которая включает не только астроциты, но также нейроны,олигодендроциты и NG2-клетки [Hachem et al., 2005].

Нами показанакоэкспрессия белка βTubIII, характерного для нейронов, и белка S100B в VH(рис. 6).В условиях ОРЗК количество S100B+-клеток снижается во всех зонахподсчѐта (рис. 5) . На 30 сутки космического полѐта, наоборот, наблюдаетсятенденция увеличения количества клеток, экспрессирующих данный белок вбелом и сером веществе поясничного утолщения.47АБВГДЖРис.

3. Экспрессия белков GFAP (красный) и S100B (желтый) в спинноммозге интактных животных (А, В, Д) и на 30 сутки от начала опорнойразгрузки задних конечностей (ОРЗК) (Б, Г, Ж) в зонах: вхождениядорсальных корешков (А и Б), вентральных рогов (В, Г) и центральногоканала (Д, Ж). Ядра визуализированы с DAPI (синий). Масштаб 100 мкм.GFAP/S100B-иммунопозитивные клетки. На 30 сутки эксперимента междуполѐтной группой и еѐ контролем по количеству GFAP+/S100B+-клетокдостоверное различие обнаружено только в DREZ (рис.

7). КоличествоGFAP+/S100B+-клеток преобладает у животных полѐтной группы. Сдвиги вколичестве GFAP/S100B-иммунопозитивных клеток при ОРЗК и в полѐтной48группы ОРЗК количество GFAP+/S100B+-клеток увеличено в каждой изисследуемых зон.По параметру флуоресцентной плотности белков GFAP (рис. 8) иS100B (рис.