Диссертация (Реакция глии спинного мозга мыши в условиях космического полёта и опорной разгрузки задних конечностей), страница 9

9) в поясничном утолщении спинного мозга выявленадостоверная разница в экспрессии этих белков в DREZ. При этом увеличениефлуоресцентной плотности белка GFAP более выражено в паре сравнениягрупп ОРЗК и интактной. В полѐтной группе достоверных различий по этомукритерию не зарегистрировано. В полѐтной группе флуоресцентая плотностьбелка S100B увеличивается в 4,1 раза по сравнению с контрольной полѐтнойгруппой.

При ОРЗК увеличение флуоресцентной плотности белка S100Bболее выражено, этот показатель взрастает в 7,3 раза по сравнению синтактной группой.Рис. 4. Количество GFAP+-клеток (ось ординат) в поясничном утолщенииспинного мозга на 30 сутки у мышей при опорной разгрузке заднихконечностей (ОРЗК) и в условиях космического полѐта. Здесь и далее вгистограммах на рис. 5, 7, 8, 9, 11, 13, 15, 16 горизонтальные отрезкиобъединяют столбцы с достоверно различающимися показателями (Р≤0,05;U-критерий Манна-Уитни-Вилкоксона).49Рис. 5.

Количество S100B+-клеток (ось ординат) в поясничном утолщенииспинного мозга на 30 сутки у мышей при опорной разгрузке заднихконечностей (ОРЗК) и в условиях космического полѐта.Рис. 6. Экспрессия белков S100B (желтый) и βTubIII (красный) нейронами на30 сутки от начала опорной разгрузки задних конечностей (ОРЗК) в спинноммозге у животных интактной группы в зоне вентральных рогов (VH).Выявлена колокализация белков S100B и βTubIII в мотонейронах;S100B+/βTubIII +-клетки отмечены стрелкой.

Ядра визуализированы с DAPI(синий). Масштаб 100 мкм.50Рис. 7. Количество GFAP+/S100B+-клеток (ось ординат) в поясничномутолщении спинного мозга на 30 сутки у мышей при опорной разгрузкезадних конечностей (ОРЗК) и в условиях космического полѐта.Причины уменьшения численности астроцитов, экспрессирующихGFAP, остаются неясными. Оно может быть результатом кумулятивногоэффекта многих негативных факторов и осуществляться как вследствиепрямого их воздействия на астроциты, так и опосредованно через нейроны иглиальные клетки других типов.

Негативное воздействие гипогравитации нацитоскелет астроцитов, в том числе на промежуточные филаменты, былопоказано ранее в опытах in vitro и in vivo [Uva et al., 2002; Nguon et al., 2004].51А)Б)Рис. 8. Флуоресцентная плотность GFAP+-клеток (зелѐный) в поясничномутолщении спинного мозга в зоне вхождения дорсальных корешков (DREZ)на 30 сутки у мышей при опорной разгрузке задних конечностей (ОРЗК) и вусловиях космического полѐта. Ядра визуализированы с DAPI (синий).Масштаб 100 мкм (А).

Флуоресцентная плотность белка GFAP значительнониже в интактной группе (Б).52А)Б)Рис. 9. Флуоресцентная плотность S100B+-клеток (красный) в зоневхождения дорсальных корешков (DREZ) в поясничном утолщении спинногомозга на 30 сутки у мышей при ОРЗК и в условиях космического полѐта.Ядра визуализированы с DAPI (синий). Масштаб 100 мкм (А).Флуоресцентная плотность белка S100B значительно возрастает в полѐтнойгруппе (Б).53Рис. 10. Экспрессия GFAP (зеленый) и S100B (красный) в поясничном отделеспинного мозга на 30 сутки у мышей при опорной разгрузке заднихконечностей (ОРЗК) и в условиях космического полѐта. При ОРЗК снижаетсяэкспрессия белка GFAP, что прослеживается также в полѐтной группе;экспрессия белка S100B увеличивается в полѐтной группе, при ОРЗК данныйпоказатель уменьшается.

Выявлена колокализация белков GFAP и S100B;GFAP+/S100B+-клетки отмечены стрелкой. Ядра визуализированы с DAPI(синий). Масштаб 100 мкм.54Миелинобразующие клеткиOlig2-иммунопозитивные клетки. У животных полѐтной и восстановленнойгрупп количество иммунопозитивных клеток во всех зонах незначительноуменьшается по сравнению с соответствующими контрольными группами(рис. 11).

Достоверный сдвиг зарегистрирован только в CST в паре сравненияполѐтной и контрольной полѐтной групп, с преобладанием данногопоказателя в контроле. При сравнении полѐтной и восстановленной групп вCST экспрессия белка Olig2 увеличивается в группе реадаптации послеполѐта. Между восстановленной группой и еѐ контролем по данному маркерудостоверных сдвигов не обнаружено. Это может свидетельствовать овосстановлении показателя на 7 сутки реадаптации на Земле после полѐта.По количеству Olig2+-клеток зарегистрированы разнонаправленныесдвиги. Если в полѐтной группе количество этих клеток незначительноуменьшается, то в группе ОРЗК, наоборот, существенно возрастает.А)55Б)Рис. 11. Экспрессия Olig2+-клеток в поясничном отделе спинного мозга умышей в условиях опорной разгрузки задних конечностей (ОРЗК),космическогополѐтаи7-суточнойреадаптациинаЗемле.А.

Иммуногистохимические реакции в зоне вхождения дорсальных корешков(DREZ) указывают на значительное увеличение количества Olig2+-клеток приОРЗК, изменения этого показателя в полѐтной и восстановленной группе необнаружены. Масштаб 100 мкм. Б. Результаты подсчѐта количества Olig2+клеток в DREZ и кортикоспинльном тракте (CST).OSP-иммунопозитивные клетки.

При сравнении животных полѐтной группыс соответствующим контролем установлено, что показатель плотностифлуоресценции белка OSP увеличивается в зоне VF, в то время как в другихзонах экспрессия данного белка остается стабильной (рис. 12, 13).Наибольшая плотность флуоресценции белка OSP во всех исследуемыхгруппах наблюдается в CST, а наименьшая в зоне CC. Различие междувосстановленной и контрольной восстановленной группами по данномупоказателю не зарегистрировано.В условиях космического полѐта снижается экспрессия белка OSP(уменьшается флуоресцентная плотность) как в сером, так и в белом56веществе. Как и у полѐтных мышей, при ОРЗК снижение экспрессии этогобелка наблюдается во всех исследуемых зонах, что может свидетельствоватьо нарушении миелинизации в спинном мозге [Furuse, Tsukita, 2002]Рис. 12.

Экспрессия белков OSP (красный) на 30 сутки эксперимента в зоневентральных рогов (VH) поясничного отдела спинного мозга у мышей вусловиях опорной разгрузки задних конечностей (ОРЗК), космическогополѐта и 7-суточной реадаптации на Земле. При ОРЗК снижается экспрессиябелка OSP, что прослеживается также в полѐтной группе. Данный показательне восстанавливается на 7 сутки реадаптаци на Земле. Ядра визуализированыс PI (розовый).

Масштаб 100 мкм.57Рис. 13. Изменение флуоресцентной плотности белка олигодендроцитов OSPв поясничном отделе спинного мозга на 30 сутки у мышей при опорнойразгрузке задних конечностей (ОРЗК) и в условиях космического полѐта.Krox20-иммунопозитивные клетки. Иммуноцитохимическая реакция натранскриптационный фактор Krox20 в спинном мозге мыши не выявилаклеток,экспрессирующихданныймаркер.Полученныерезультатысогласуются с данными Herdegen et al. (1993) о том, что Krox20+-клетки вспинном мозге половозрелых грызунов отсутствуют.В ходе исследования обнаружены маркеры миелиновой оболочкипериферических нервов – белки P0 (MPZ) и Krox24.

В глиальных клеткахвыявлена мембранная локализация белка P0 и ядерная локализациятранскрипционного фактора Krox24.P0-иммунопозитивные клетки. Присутствие P0+-клеток в спинном мозгемыши практически не изучено и требует дополнительного исследования.

У58животных контрольной полѐтной группы P0+-клетки были распределенынеравномерно с преобладанием в DREZ (рис.14). У мышей полѐтной группыколичество P0+-клеток значительно снижено в VH и DREZ. Аналогичнаякартина наблюдается при сравнении восстановленной и контрольнойвосстановленной групп.Вполѐтнойивосстановленнойполѐтнойгруппахсдвигивбольшинстве исследуемых зон однонаправленны и одинаково выражены,причем количество P0+-клеток в полѐтной и восстановленной группахснижается. Исключением являются зоны СС и VF в паре сравнениявосстановленной и контрольной восстановленнойгрупп (рис. 15А).Изменения количества имммунопозитивных клеток в группах сравненияОРЗКиинтактныхживотныхсоответствуютвыраженностиинаправленности сдвигов, зафиксированных в полѐтной и контрольнойполѐтной группах.Белок Р0 является важнейшим компонентом миелина, регулирующимукладку слоев миелиновой оболочки.

Нарушение экспрессии белка P0 прикосмическом полѐте и симуляции невесомости на Земле может приводить кдефектам миелинизации. При ОРЗК показано снижение экспрессиимиелинспецифичных генов pmp2 и pmp22, кодирующих белки, которыепринимают участие в образовании и стабилизации миелиновой оболочки[Исламов и др., 2013]. Полученные данные по экспрессии маркеровмиелинобразующих клеток в спинном мозге согласуются с доказательствамиприсутствия белков Krox24, P0, p75 не только в структурах периферическойнервной системы, но и в ЦНС [Jasmin et al., 2000; Nagoshi et al., 2011].Krox24-иммунопозитивные клетки.

Подсчѐт количества Krox24+-клетокпоказал достоверное различие при сравнении животных полѐтной иконтрольной полѐтной групп в сером веществе (рис 14, 15Б). КоличествоKrox24+-клеток увеличивается в группе с полѐтными животными в VH,DREZ и СС в 2,3; 4,2 и 4,3 раза, соответственно. В паре сравнениявосстановленной и контрольной восстановленной групп изменений ни в59однойизисследуемыхзоннезарегистрировано.Отмеченыоднонаправленные сдвиги в восстановленной и полѐтной группах, ввосстановленной группе наблюдается значительное снижение количестваKrox24+-клеток в белом веществе (VF и CST).

Сдвиги при ОРЗК и в полѐтнойгруппах разнонаправленны и наиболее выражены в группе ОРЗК. У мышейгруппыОРЗКколичествоKrox24+-клетокувеличеновкаждойизисследуемых зон.Транскрипционный фактор Krox24 относится к белкам раннегоответа,участвуетврегуляцииклеточногоцикла,дифференцировкемиелинобразующих клеток и индуцируется влияниями со стороны нейронов.Снижение экспрессии этого белка может быть следствием нарушениявзаимоотношений между нейронами и глией.P0/Krox24-иммунопозитивные клетки. Между полѐтной и контрольнойполѐтнойгруппамиподанномупоказателюдостоверноеразличиеобнаружено только в белом веществе (VF и CST) с преобладаниемколичества P0+/Krox24+-клеток у животных контрольной полѐтной группы.

Впаре сравнении восстановленной и контрольной восстановленной групп неотмеченодостовернойразницыниводнойиззонподсчѐта.Ввосстановленной группе не зарегистрировано восстановления количестваP0+/Krox24+-клеток, что может быть связано с недостаточно длительнымпериодом наблюдений для восстановления этого параметра.Изменения количества P0+/Krox24+-клеток в паре сравнения групп ОРЗК иинтактных мышей аналогичны сдвигам в полѐтной группе.

В сером веществеу животных группы ОРЗК эти сдвиги выражены в большей мере. В беломвеществе наиболее заметные различия по этому показателю зафиксированы впаре сравнения полѐтной и контрольной полѐтной групп.60Рис. 14. Зона вхождения дорсальных корешков (DREZ) в поясничном отделеспинного мозга у мышей в условиях космического полѐта и 7-суточнойреадаптации на Земле.