Диссертация (Реакция глии спинного мозга мыши в условиях космического полёта и опорной разгрузки задних конечностей)

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИФГБОУ ВО «КАЗАНСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙМЕДИЦИНСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ»На правах рукописиПовышева Татьяна ВячеславовнаРЕАКЦИЯ ГЛИИ СПИННОГО МОЗГА МЫШИ В УСЛОВИЯХКОСМИЧЕСКОГО ПОЛЁТА И ОПОРНОЙ РАЗГРУЗКИ ЗАДНИХКОНЕЧНОСТЕЙ03.03.04 – клеточная биология, цитология, гистологияДиссертация на соискание ученой степеникандидата биологических наукНаучный руководитель:доктор медицинских наукпрофессор Челышев Ю.А.1ОГЛАВЛЕНИЕСтр.1. ВВЕДЕНИЕ32. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ92.1 Патологические реакции при гипогравитационном9двигательном синдроме2.2 Реакция глии при патологии спинного мозга122.2.1 Астроциты122.2.2 Миелинобразующие клетки232.2.3 Микроглия292.3 Нейральные клетки при стрессе322.4 Модели для исследования гипогравитационного34двигательного синдрома2.5 Исследования нервной ткани в условиях реальной37невесомости и еѐ моделирования на Земле3.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ413.1 Экспериментальные группы413.2 Приготовление гистологических препаратов423.3 Иммуногистохимические методы433.4 Морфометрия433.5 Статистическая обработка результатов454. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ464.1 Поясничный отдел спинного мозга464.2 Шейный отдел спинного мозга655. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ736. ЗАКЛЮЧЕНИЕ877. ВЫВОДЫ918. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ929. СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ12521.

ВВЕДЕНИЕАктуальность исследования и степень разработанности темыГипогравитациянарушаетфункциюпрактическивсехсистеморганизма, что проявляется на молекулярном, клеточном и тканевом уровнях[Caiozzo et al., 1996; Григорьев и др., 2004; Kozlovskaya et al., 2007]. При этомуже в течение первых суток в скелетных мышцах, обеспечивающихподдержание позы, развиваются нарушения, которые составляют основугипогравитационного двигательного синдрома [Ohira et al., 2002; Kozlovskayaet al., 2007; Fitts et al., 2010]. Исследования двигательной функции вневесомости и в условиях еѐ моделирования на Земле выявили сдвиги во всехкомпонентах регуляции двигательной системы [Edgerton, 1996; Reschke et al.,1998; Nagy et al., 2000; Григорьев и др., 2004]. Гипогравитационныйдвигательный синдром характеризуется атрофией мышц, сопровождающейсяуменьшением объѐма мышечных волокон и деструкцией миофибриллярногоаппарата [Шумилина и др., 2010].

При этом установлена важная рольсенсорного обеспечения двигательных функций [Козловская и др., 1984;Kozlovskaya et al., 1988]. При гипогравитационном двигательном синдрометакже отмечается снижение афферентной стимуляции мотонейронов или ихдеафферентация, которая приводит к повышенной возбудимости нейронов[Kozlovskaya et al., 2007].Патогенез гипогравитационного двигательного синдрома можетвключать не только изменения сократительного аппарата мышцы, но инарушение механизма экзоцитоза медиатора и структур, контролирующихего регуляцию [Никольский и др., 2005]. В условиях моделированиягипогравитации на Земле в виде опорной разгрузки задних конечностей(ОРЗК)увеличиваетсясодержаниевозбуждающихитормозныхнейромедиаторов в спинном мозге [Treffort et al., 2006]. На модели ОРЗКпоказано снижение активности холинацетилтрансферазы, которое приводит кразвитию характерных для гипогравитационного двигательного синдрома3изменений со стороны скелетной мышцы [Исламов и др., 2007; 2008].Морфо-функциональные изменения в нейронах в условиях космическогополѐта могут быть первичными или опосредоваться через влияния состороны глиальных клеток.

При этом роль глиального компонента иинформационных межклеточных взаимодействий в системе «нейрон – глия»в развитии гипогравитационного двигательного синдрома остаѐтся неясной.Есть основание полагать, что изменение характера взаимодействий междунейронами и глией в спинном мозге при гипогравитационном двигательномсиндроме может приводить к сдвигам в морфофункциональном состояниимотонейронов.Астроцитам принадлежит ведущая роль в регуляции гомеостаза калия,удаленииизвнеклеточногоантиоксидантной защите,пространстваизбыточногометаболическом обеспечениииглутамата,модуляциивозбудимости нейронов [Hulsebosch et al., 2009; Clarke, Barres, 2013].Активация астроцитов в спинном мозге негативно влияет на соседниенервные клетки [Jing et al., 2013], увеличивая экспрессию провоспалительныхцитокинов, концентрацию АТФ и оксида азота [Hulsebosch et al., 2009;Karimi-Abdolrezaee, Billakanti, 2012].

Изменение характера взаимодействий всистеме «нейрон – астроцит» не только влияет на функцию мотонейронов, номожет также явиться причиной выраженных нарушений их структурной ицитохимической организации. Представляется весьма вероятным, что этиреакции могут завершиться дегенерацией и гибелью мотонейронов.При гипогравитационном двигательном синдроме демиелинизацияможет сопровождать и усиливать двигательные нарушения.

На модели ОРЗКмолекулярно-генетический анализ выявил снижение в спинном мозгеэкспрессии генов pmp2 и pmp22, кодирующих белки миелина, котороеприводит к дефектам миелинизации [Тяпкина и др., 2013] и изменениюскорости проведения импульсов по аксонам [Исламов и др., 2011]. Остаетсяоткрытым вопрос об изменении фенотипа миелинобразующих клеток впатогенезе развития гипогравитационного двигательного синдрома.4Реакциямикроглиальныхклетокпригипогравитационномдвигательном синдроме также практически не изучена. Микроглия, какрезидент иммунной системы в ЦНС, является одним из важных компонентовв регуляции гомеостаза в мозге.

Активация микроглии усиливает гибельнейронов,чтопоказаноприболезниАльцгеймера,боковомамиотрофическом склерозе и травме спинного мозга [Ribes et al., 2009; Tsuda,2016].Дляисследованиявоздействиягипогравитациинаорганизмиспользуют различные экспериментальные модели, такие как «сухая»иммерсионная гипокинезия, иммобилизация и т.п. [Саенко и др., 2000].

Приэтом среди них модель ОРЗК представляется наиболее оптимальной дляимитации патологических сдвигов в условиях космического полѐта. Этамодель в наибольшей мере способствовала расшифровке известных насегодняшний день механизмов развития гипогравитационного двигательногосиндрома.На модели ОРЗК было показано повышение уровня экспрессии белковHSP25 и HSP70, препятствующих развитию апоптоза в спинном мозге[Islamov et al., 2007; 2011]. При изучении мотонейронов поясничногоутолщения спинного мозга мышей после 30-суточного космического полѐтавыявленоснижениесинаптофизина,экспрессиикоторыебелковиграютHSP25,важнуюрольHSP70,вPSD95иадаптационно-компенсаторных процессах [Тяпкина и др., 2014].Возможность изменения в условиях космического полѐта и ОРЗКфенотипа и поведения глиальных клеток как причинынарушениявзаимодействий между нейронами и глией и последующих патологическихсдвигов в морфофункциональном состоянии мотонейронов не изучена.Представляется актуальным оценить роль макро- и микроглиальных клетокспинного мозга в патогенезе гипогравитационного двигательного синдрома вусловиях ОРЗК и космического полѐта.5Цели и задачи исследованияЦель исследования – выявить реакции глии спинного мозга мыши вусловиях космического полѐта и имитирования гипогравитации на Земле.Для достижения цели поставлены следующие задачи, решаемые вусловиях космического полѐта по международному проекту БИОН-М1 и намодели ОРЗК:1.

Проанализироватьреакциюастроцитов,миелинобразующихимикроглиальных клеток в сером и белом веществе спинного мозгамыши в условиях космического полѐта и ОРЗК на Земле.2. В условиях реадаптации мышей на Земле после космического полѐтапроанализировать динамику фенотипических изменений макро- имикроглиальных клеток в сером и белом веществе поясничного ишейного отделов спинного мозга.3. Сопоставитьфенотипическиехарактеристикиглиальныхклетокпоясничного и шейного отдела при ОРЗК и космическом полѐте поэкспрессиимаркеровастроцитов,миелинобразующихимикроглиальных клеток в сером и белом веществе спинного мозгамыши.Научная новизнаВпервые получены новые данные о реакции астроцитов, а такжемиелинобразующих и микроглиальных клеток в зонах серого и белоговещества в области поясничного утолщения спинного мозга мыши вусловиях 30-суточного космического полѐта.

Впервые установлено, чтопребывание мышей в этих условиях и при ОРЗК приводит к фенотипическимсдвигам в популяциях астроцитов в поясничном и шейном утолщенияхспинного мозга. Принципиально новыми являются данные о том, что вусловиях космического полѐта и ОРЗК в поясничном утолщении спинногомозгаколичествомиелинобразующихклетокуменьшается,амикроглиальных клеток в поясничном и шейном утолщениях возрастает.Впервые показано, что увеличение экспрессии маркеров миелинобразующих6клеток на 7 сутки реадаптации на Земле после космического полѐтасвидетельствует о восстановлении отклоняющихся показателей и указываетна потенциальную возможность достаточно быстрого восстановлениямиелинизированныхволоконпригипогравитационномдвигательномсиндроме.

Получены приоритетные данные об отличительных особенностяхфенотипических сдвигов глиальных клеток спинного мозга при космическомполѐте и ОРЗК.Теоретическое и практическое значение работыПолученные в работе данные о реакции астроцитов, а такжемиелинобразующих и микроглиальных клеток в сером и белом веществепоясничного и шейного отделов спинного мозга мыши в условияхкосмического полѐта и ОРЗК углубляют представления о механизмахразвития гипогравитационного двигательного синдрома.Данные проведѐнных исследований могут быть использованы прирассмотрения глии в качестве мишени при разработке средств профилактикимоторных расстройств при гипогравитационном двигательном синдромеприв условиях длительных космических полѐтов.Положения, выносимые на защиту1.

В условиях космического полѐта и опорной разгрузки заднихконечностей при развитии гипогравитационного двигательного синдромаизменяются фенотипы клеток макро- и микроглии в шейном ипоясничном отделах спинного мозга.2. РеадаптациянаЗемлепослекосмическогополѐтавключаетвозможность нормализации фенотипических сдвигов глиальных клетокспинного мозга.Методология и методы исследованияДиссертационная работа представляет собой иммунофлуоресцентноеисследование шейного и поясничного отделов спинного мозга мыши после30-суточного космического полѐта и ОРЗК с целью определения роли глии впатогенезегипогравитационногодвигательного7синдрома.Дизайнисследования отражен в протоколе, одобренном локальным этическимкомитетом Федерального государственного бюджетного образовательногоучреждениявысшегообразования«Казанскийгосударственныймедицинский университет» Министерства здравоохранения РоссийскойФедерации.

В исследовании использовались иммунофлуоресцентные методыи морфометрия, а также статистические инструменты анализа данных.Степень достоверностиДостоверность результатов исследования определяется дoстатoчнымoбъемoм и кoрректным фoрмирoванием изучаемых выбoрoк, высoкoйинфoрмативнoстью сoвременных метoдoв исследoвания, адекватнoстьюматематическихметoдoвoбрабoткиданныхпoставленнымзадачам.Сформулирoванные вывoды и практические рекoмендации аргументирoваныи лoгически вытекают из результатoв исследoвания.Апробация материалов диссертацииПо теме диссертации опубликовано 13 печатных работ, из них 4статьи в рецензируемых научных журналах, рекомендованных ВАК.ОсновныеположенияирезультатыработыдоложенынаМеждународных молодежных научных конференциях «Ломоносов» (Москва,2013, 2014, 2015), Международной научной конференции «COSPAR»(Москва, 2014), VIII Всероссийском с международным участием конгрессе«Симбиоз-Россия 2015» (Новосибирск, 2015), XI Международной научнопрактической конференции «Пилотируемые полѐты в космос» (Звѐздныйгородок,2015),«МолодѐжьиIIIмежвузовскоймедицинскаянаучно-практическойнаука»(Тверь,2015),конференцииМеждународнойконференции «Пилотируемое освоение космоса» (Москва, 2016), ХIIIКонгрессе Международной ассоциации морфологов (Петрозаводск, 2016).82 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ2.1 Патологические реакции при гипогравитационном двигательномсиндромеЖивой организм находится под воздействием притяжения Земли.Силапритяженияформируетфункциискелетноймускулатуры,гравитационные рефлексы, координированную мышечную работу.