Автореферат (Состояние микробиоценоза толстой кишки при экспериментальном дисбиозе и его коррекции), страница 3

После чего делали разведениематериала до 10-2-10-4 для посева на питательные среды, термостатирования,изучения микробиоценоза ТК каждой группы животных и приготовленияпрепаратов для микроскопирования после окраски по Граму. По 0,1 мл образцакаждого разведения засевали газоном на поверхности питательных сред (Эндо,кровяной агар, желточно-солевой агар, Сабуро, SS-агар, лактоагар, ЦПХ-агар,висмут-сульфит агар, бифидоагар) и инкубировали в аэробных и анаэробныхусловиях при температуре 37 0С. Число выросших колониеобразующих единиц(КОЕ) микроорганизмов для оценки количества микроорганизмов в 1г материала(рост не менее 10 колоний), определяли с учетом объёма посевного материала иразведения. Расчеты проводили по следующей формуле: К=Е/к·v·n, где К – КОЕ, Е –общее количество бактерий, к – количество внесённого материала, v – количествочашек Петри, n – разведение.

Удельное содержание микроорганизмов выражали вlgКОЕ/г массы биологического материала. Идентификацию микроорганизмовпроводили с помощью микробиологического анализатора «Multiskan-Ascent» с12использованием промышленных тест-систем ЭНТЕРОтест-16, СТАФИтест-16,Стрептотест-16,Эн-КОККУСтест-16,API50CHL[ВоробьевА.А.,2005;Несвижский Ю.В., 2007].Оценка состояния системы АОЗ организма и процессов липопероксидации.Активность SOD определяли спектрофотометрически. Оптическую плотностьизмеряли на спектрофотометре «Apel 330 PD» (Япония) при длине волны 540 нм.Результаты по активности выражали в условных единицах – за условную единицуактивности SOD принимали 50% торможение реакции восстановления нитросинеготетразолия.

Активность KAT определяли также спектрофотометрически. Данныйметод основан на способности перекиси водорода образовывать с солями молибденастойкий окрашенный комплекс. Интенсивность окраски измеряли при длине волны410 нм с использованием спектрофотометра «Apel 330 PD» (Япония).

АктивностьKAT выражали в мкат/г ткани в колоноцитах или мкат/мл в плазме крови[Кушманова О.Д., 1983; Строев В.А., 1986; Королюк М.А., 1988; Макаренко Е.В.,1988].Содержание AGP в организме определяли спектрофотометрически. Данныйметод основан на образовании гептанового слоя при смешении гептана иизопропана с добавлением соляной кислоты. Оптическую плотность измеряли наспектрофотометре «Apel 330 PD» (Япония) при длине волны 233 нм, результатоценивали в условных единицах активности.

Содержание MDA также оценивалиспектрофотометрически. Данный метод основан на том, что при взаимодействииMDA с двумя молекулами тиобарбитуровой кислоты при нагревании образуетсяокрашенный триметиновый комплекс с максимумом поглощения при 532 нм.Измерения проводили с использованием спектрофотометра «Apel 330 PD» (Япония).Количество MDA рассчитывали с помощью наборов «ТБК-Агат». Результатывыражали в мкмоль/г ткани в колоноцитах и мкмоль/л в плазме крови [Строев В.А.,1986; Дерюгина А.В., 2010; Некрасов Э.В., 2012].Статистическая обработка полученных данных.

Статистическую обработкуданных проводили с использованием аналитического пакета приложения ExcelOffice 2010 с применением библиотеки статистических функций, лицензией на13правоиспользованиякоторогообладаетФГБОУВОКГМУ.Проверкураспределения данных на соответствие нормальному закону распределенияосуществляли с помощью критерия согласия распределения КолмогороваСмирнова.Присоответствииэмпирическогораспределениянормальномутеоретическому распределению критический уровень статистической значимости(p) принимали равным 0,05. Для описания количественных признаков использовалипараметры нормального распределения: среднее значение (M), стандартная ошибкасреднего значения (±m), стандартное отклонение (s).

Для оценки значимостиразличий двух групп независимых наблюдений использовали параметрическийкритерий – t-критерий Стьюдента после дополнительной проверки равенствадисперсий двух сравниваемых групп посредством F-критерия Фишера – Снедекора.Дляоценкивзаимосвязейисследуемыхпоказателейиспользовалиметодымногомерной статистики. Проверку наличия взаимосвязи между изучаемымипеременными осуществляли с использованием КАметодом Пирсона. Дляразделения данных на группы однородности и оценки надежности и точностивыводов, сделанных на основании ограниченного статистического материала, в КЛАиспользовали иерархическую агломеративную процедуру с объединением данных вкластеры по правилу одиночной связи, в качестве метрики использовали величину,обратную коэффициенту корреляции Пирсона. При оценке результатов КЛАучитывали только статистически значимые взаимосвязи при р<0,05.

В ДА длявыбора значимых переменных использовали пошаговый метод с исключением,основанный на использовании уровня значимости F-статистики [Реброва О.Ю.,2006; Мешалкина Ю.Л., 2008].ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫСостояние мукозной микробиоты ТК мышей, биохимических показателейколоноцитов и плазмы крови в условиях антибиотик-ассоциированного ДБ.Экспериментальныйгентамицин-ассоциированныйДБТКхарактеризовалсяуменьшением численности доминантных представителей микробиоты (E.coli(lac«+»), Lactobacillus spp., Bifidobacterium spp.), что оказало влияние на развитие14Streptococcus spp., Staphylococcus spp.

(коагулазоотрицательные), Enterobacter spp.,Staphylococcus aureus и Proteus spp., Candida spp. (таблица 1).Таблица 1 Состав мукозной микробиоты ТК мышей в условиях ДБ и его коррекцииКоличество микроорганизмов, lgKOE/г (M±m)группа животных (n=50)Вид микроорганизмовкоррекциякоррекцияконтрольДБбактистатином нормобактомE. coli (lac«+»)6,58±0,75 3,18±0,46***6,63±0,58(ххх)6,35±0,73(ххх)E.

coli (lac«-»)3,48±0,575,22±0,733,76±0,463,31±0,90Enterobacter spp3,01±0,47 5,08±0,48**5,85±0,78**5,61±0,78*Salmonella spp.5,07±0,636,14±0,763,04±0,68* (хх)4,79±0,69***(ххх)Citrobacter spp.3,74±0,720±04,27±0,683,14±0,72(ххх)Enterococcus spp.3,85±0,900±0***5,85±0,71(ххх)0±0******(ххх)Streptococcus spp.2,14±0,55 6,64±0,783,21±0,514,34±0,68* (х)Staphylococcus spp. (коаг. отриц.) 2,54±0,67 5,87±0,94**3,14±0,66(х)2,90±0,64(х)***(ххх)Staphylococcus aureus05,87±1,480±00±0(ххх)Proteus spp.03,12±0,45***0±0(ххх)0±0(ххх)Candida spp.2,38±0,49 5,43±0,90**1,25±0,55(ххх)2,34±0,75(хх)*(х)Lactobacillus spp.6,48±0,66 3,60±0,826,43±0,856,81±0,79(хх)Bifidobacterium spp.8,10±1,05 4,76±0,94*8,60±1,02(хх)7,78±1,22Продолжение таблицы 1Вид микроорганизмовE. coli (lac«+»)E.

coli (lac«-»)Enterobacter sppSalmonella spp.Citrobacter spp.Enterococcus spp.Streptococcus spp.Staphylococcus spp. (коаг. отриц.)Staphylococcus aureusProteus spp.Candida spp.Lactobacillus spp.Bifidobacterium spp.Количество микроорганизмов, lgKOE/г (M±m)группа животных (n=50)профилактикакоррекциякоррекция мексидолом,мексидоломмексидоломбактистатином(х)(х)4,97±0,575,16±0,646,55±0,94(хх)5,62±0,21***4,87±0,29*1,14±0,33***(ххх) (ооо) (zzz)****4,80±0,526,12±0,545,62±0,72**5,89±0,756,11±0,724,02±0,81*** (ххх)***0±00±03,12±0,61(ххх) (zzz)*** (ххх)***0±00±06,12±0,81(ххх) (zzz)5,20±0,83**5,54±0,65***3,02±0,80(хх) (z)*****5,87±0,645,46±0,681,02±0,66(ххх) (о) (zzz)2,93±0,55***3,08±0,40***0(ххх) (zzz)******3,76±0,643,54±0,590(ххх) (zzz)5,14±0,44***5,52±0,52***0*** (о) (zzz)4,34±0,27**5,48±0,687,76±0,67(ххх) (z)*5,12±0,475,72±0,798,76±1,17(х) (z)Примечание: * - р≤0,05 по сравнению с контрольной группой, ** - р≤0,01 по сравнению с контрольнойгруппой, *** - р≤0,001 по сравнению с контрольной группой; х - р≤0,05 по сравнению с группой ДБ, хх р≤0,01 по сравнению с группой ДБ, ххх - р≤0,001 по сравнению с группой ДБ; о - р≤0,05 по сравнению сгруппой коррекция бактистатином, ооо - р≤0,001 по сравнению с группой коррекция бактистатином; z р≤0,05 по сравнению с группой коррекция мексидолом, zzz - р≤0,001 по сравнению с группой коррекциямексидоломПри ДБ увеличилось содержание MDA и AGP в плазме крови и в колоноцитах(таблица 2).15Таблица 2 Содержание продуктов ПОЛ в условиях ДБ и его коррекцииСодержание MDA, (М±m)плазма,колоноциты,мкмоль/лмкмоль/г ткани2,41±0,182,32±0,193,98±0,31***4,67±0,37***Группа животных(n=50)КонтрольДБКоррекциябактистатиномКоррекциянормобактомПрофилактикамексидоломКоррекциямексидоломКоррекциямексидолом,бактистатиномСодержание AGP, (М±m)плазма, у.е.колоноциты, у.е0,86±0,071,24±0,10**0,35±0,040,82±0,06***3,69±0,21***3,57±0,18*** (х)1,02±0,070,68±0,06***3,50±0,30**3,16±0,19** (ххх)1,06±0,060,71±0,07***3,10±0,22* (х)3,11±0,37хх0,90±0,06хх0,41±0,03ххх2,44±0,19ххх2,34±0,21ххх0,63±0,05* (ххх)0,26±0,02ххх2,27±0,39(хх) (оо)2,92±0,20* (ххх) (о)0,61±0,16(хх) (о)0,15±0,04**(ххх) (z)Примечание: * - р≤0,05 по сравнению с контрольной группой, ** - р≤0,01 по сравнению с контрольнойгруппой, *** - р≤0,001 по сравнению с контрольной группой; х - р≤0,05 по сравнению с группой ДБ, хх р≤0,01 по сравнению с группой ДБ, ххх - р≤0,001 по сравнению с группой ДБ; о - р≤0,05 по сравнению сгруппой коррекция бактистатином, оо - р≤0,01 по сравнению с группой коррекция бактистатином, z - р≤0,05по сравнению с группой коррекция мексидоломПри экспериментальном антибиотик-ассоциированном ДБ установлено снижениеактивности ферментов KAT и SOD (таблица 3).Таблица 3 Активность ферментов АОЗ в условиях ДБ и его коррекцииАктивность KAT, (М±m)Активность SOD, (М±m)Группа животныхплазма,колоноциты,колоноциты,(n=50)плазма, у.е.мкат/млмкат/г тканиу.еКонтроль11,87±1,1113,88±0,8514,47±0,7415,85±1,03ДБ9,18±0,58*10,63±0,54**11,77±0,62** 8,14±0,87***Коррекция бактистатином13,52±0,86ххх12,26±0,6515,45±0,98хх 14,15±1,07ххххххКоррекция нормобактом14,43±0,7511,64±0,6714,68±0,99х 14,83±0,68хххПрофилактика мексидолом11,25±0,62х14,65±1,53х14,13±0,84х 14,49±0,97ххх15,49±1,25*18,95±1,23***17,30±0,95*Коррекция мексидолом17,19±0,95ххх(ххх)(ххх)(ххх)Коррекциябактистатиноммексидолом,19,44±1,23*** (ххх) (ооо) (z)24,01±1,10*** (ххх) (ооо) (zz)20,30±1,01*** (ххх) (оо) (z)20,46±1,05** (ххх) (ооо) (z)Примечание: * - р≤0,05 по сравнению с контрольной группой, ** - р≤0,01 по сравнению с контрольнойгруппой, *** - р≤0,001 по сравнению с контрольной группой; х - р≤0,05 по сравнению с группой ДБ, хх р≤0,01 по сравнению с группой ДБ, ххх - р≤0,001 по сравнению с группой ДБ; оо - р≤0,01 по сравнению сгруппой коррекция бактистатином, ооо - р≤0,001 по сравнению с группой коррекция бактистатином; z р≤0,05 по сравнению с группой коррекция мексидолом, zz - р≤0,01 по сравнению с группой коррекциямексидоломДлявыявлениявзаимосвязимеждусоставоммикробиоценозаТК,количественным содержанием продуктов ПОЛ и активностью ферментов системыАОЗ колоноцитов был проведен КА.