Автореферат (Создание новых комплексных ферментных препаратов грибных протеаз на основе штамма Penicillium canescens для эффективной конверсии белоксодержащего растительного сырья)

На правах рукописиВЕЛИКОРЕЦКАЯИрина АлександровнаСОЗДАНИЕ НОВЫХ КОМПЛЕКСНЫХ ФЕРМЕНТНЫХ ПРЕПАРАТОВ ГРИБНЫХПРОТЕАЗ НА ОСНОВЕ ШТАММА PENICILLIUM CANESCENS ДЛЯ ЭФФЕКТИВНОЙКОНВЕРСИИ БЕЛОКСОДЕРЖАЩЕГО РАСТИТЕЛЬНОГО СЫРЬЯСпециальность 05.18.07 – Биотехнология пищевых продуктов и биологически активныхвеществАВТОРЕФЕРАТдиссертации на соискание ученой степеникандидата технических наукМосква – 20192Работа выполнена во Всероссийском научно-исследовательском институте пищевойбиотехнологии – филиале Федерального государственного бюджетного учреждения наукиФедерального исследовательского центра питания, биотехнологии и безопасности пищи(ВНИИПБТ – филиал ФГБУН «ФИЦ питания и биотехнологии»)Научный руководитель:Синицын Аркадий Пантелеймоновичдоктор химических наук, профессорОфициальные оппоненты:Гернет Марина Васильевнадоктор технических наук, профессор, руководитель отделатехнологиипивоваренияВНИИпивоваренной,безалкогольной и винодельческой промышленности –филиал ФГБНУ «Федеральный научный центр пищевыхсистем им.

В.М. Горбатова» РАНГоршина Елена Сергеевнакандидатбиологическихнаук,доценткафедры«ХимБиотех» ФГБОУ ВО «Московский политехническийуниверситет»Ведущая организация:Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им.Г.К. Скрябина Российской академии наук – обособленноеподразделениеФедеральногогосударственногобюджетногоучреждениянауки«Федеральныйисследовательский центр «Пущинский научный центрбиологических исследований Российской академии наук»Защита диссертации состоится «____» ________2019 года в ___ часов на заседаниидиссертационного совета Д 212.148.11 при ФГБОУ ВО «Московский государственныйуниверситет пищевых производств» по адресу: 125080, г.

Москва, Волоколамское шоссе, д.11,ауд. ___.С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБОУ ВО «Московскийгосударственный университет пищевых производств». Полный текст диссертации размещен всети Интернет на официальном сайте ФГБОУ ВО МГУППС авторефератом диссертации можно ознакомиться на сайте ВАК Министерстваобразования и науки РФ по адресу: http://vak.ed.gov.ru и ФГБОУ ВО «Московскийгосударственный университет пищевых производств».Автореферат разослан «___»________2019 г.Ученый секретарьДиссертационного совета Д 212.148.11,к.т.н., доцентКусова ИринаУрузмаговна3ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫАктуальность темы. В настоящее время пищевая и перерабатывающаяпромышленность Российской Федерации является одной из стратегических отраслейэкономики, обеспечивающей население страны необходимыми качественными продуктамипитания.

В России разработана и реализуется Стратегия развития пищевой иперерабатывающей промышленности Российской Федерации на период до 2020 года,нацеленная на создание необходимых условий для модернизации промышленности,формирование нового технологического уклада, повышение технического уровня производстваза счет использования современных достижений научно-технического прогресса, а такжерешение проблемы импортозамещения. Среди поставленных задач – необходимость внедренияновых технологий в отрасли пищевой и перерабатывающей промышленности, в том числебиотехнологий, позволяющих значительно расширить выработку продуктов нового поколения сзаданными качественными характеристиками, повысить глубину переработки, что позволитувеличить выход готовой продукции с единицы перерабатываемого сырья.Одним из видов сырья пищевой промышленности является белоксодержащеерастительное сырье.

Для его эффективной конверсии широко используются протеолитическиеферментные препараты (ФП), однако большинство из них выпускаются зарубежнымипроизводителями. Применение протеаз с различной специфичностью действия позволяетповысить пищевую и кормовую ценность сырья, улучшить его технологические свойства,повысить качество и увеличить выход готовой продукции, а также снизить ее себестоимость.Одним из крупномасштабных потребителей ферментов микробного происхожденияявляется спиртовая отрасль, перерабатывающая более 2 млн. тонн зерна в год. Перспективнымнаправлением интенсификации спиртового производства является гидролиз зернового белка.Обработка сусла кислыми протеазами повышает атакуемость крахмала зернаамилолитическими ферментами за счет разрушения углеводно-протеиновых связей иобеспечивает дрожжи легкоусвояемым азотистым питанием. Использование комплексагрибных протеаз эндо- и экзодействия позволяет сократить время сбраживания и снизитьстепень белкового загрязнения оборудования. Таким образом, применение протеаз позволяетинтенсифицировать процесс дрожжегенерации и брожения, что способствует увеличениювыхода этилового спирта, в том числе, пищевого.В последнее время активным потребителем микробных протеаз также становится рыноккормовых ферментов.

Использование ФП протеолитического действия позволяет заменятьдорогостоящие компоненты кормовых рационов более дешевыми зерновыми и бобовымикультурами, повышает питательную ценность и усвояемость кормов, облегчает соблюдениесанитарно-гигиенических норм их содержания и повышает продуктивность животных.Применение протеолитических ферментов позволяет снизить затраты на производство мясасельскохозяйственных животных и птицы, повысить конкурентоспособность продукции.Перспективными продуцентами коммерческих протеолитических ФП, в том числеаспартатных (кислых) протеаз и экзопептидаз, являются мицелиальные грибы, которыехарактеризуются высокой продуктивностью и способностью к синтезу широкого спектра4гидролитических ферментов при культивировании на относительно дешевых ферментационныхсредах, что существенно удешевляет процесс получения ФП.

В настоящее время на российскомрынке ассортимент отечественных ФП грибных протеаз ограничен в связи с их высокойстоимостью – для организации рентабельного производства таких ФП необходимывысокоактивные штаммы-продуценты, способные к биосинтезу требуемого комплекса целевыхферментов.В данной работе для получения высокоактивного рекомбинантного продуцентакомплекса протеолитических и сопутствующих ферментов был использован штамм-реципиентPenicillium canescens RN3-11-7 niaD-, ранее успешно применявшийся для получениявысокоактивных рекомбинантных продуцентов карбогидраз в ФИЦ Биотехнологии РАН.Следует отметить, что этот штамм синтезирует собственный комплекс гемицеллюлаз, в первуюочередь, ксиланазу и β-глюканазу, что является дополнительным преимуществом припереработке растительных субстратов, в частности, в пищевых производствах.Работа посвящена созданию высокоактивных продуцентов протеолитических ферментовна основе штамма P.

canescens RN3-11-7 niaD-, обладающего собственнойгемицеллюлолитической активностью, что позволит получить конкурентоспособныекомплексные ФП для повышения эффективности биотехнологических процессов переработкирастительного белоксодержащего сырья в пищевой и кормовой отраслях агропромышленногокомплекса (АПК).Целью данной работы была интенсификация технологических процессов и повышениевыхода и качества продукции пищевой (спиртовой) промышленности и других отраслях АПКза счет применения полученных на основе высокоактивных рекомбинантных штаммов P.canescens новых отечественных комплексных ФП, содержащих протеазы с широкойспецифичностью действия, а также гемицеллюлазы.В соответствии с этой целью были поставлены следующие задачи: Осуществить трансформацию штамма-реципиента P. canescens RN3-11-7 niaDплазмидами, несущими гены кислой аспартатной протеазы, грибной сериновой протеазыи лейцинаминопептидазы. Провести скрининг трансформантов, выделить их высокоактивные варианты. Получить на основе новых штаммов комплексные препараты протеаз и гемицеллюлаз иизучить их свойства и компонентный состав. Провести производственные испытания по наработке промышленных ФП на основеновых штаммов. Исследовать гидролитические свойства новых ФП по отношению к различным видамбелоксодержащего растительного сырья для интенсификации технологических стадийспиртового и других производств за счет использования новых ФП.Научная новизна.

Впервые для получения новых продуцентов протеаз длятрансформации реципиентного штамма P. canescens RN3-11-7 niaD- были успешноиспользованы векторные конструкции, содержащие гены ферментов протеолитическогокомплекса – кислой аспартатной протеазы, сериновой протеазы и лейцинаминопептидазы.5Впервые методами генной инженерии получены новые продуценты комплексных ФПпротеолитического и гемицеллюлолитического действия.Изучены физико-химические свойства новых комплексных препаратов протеаз игемицеллюлаз, компонентный состав этих препаратов, а также их эффективность при обработкеразличных видов белоксодержащего растительного сырья в опытах in vitro и in vivo.Научно-практическая значимость работы.

Созданы новые рекомбинантныепродуценты на основе штамма-реципиента P. canescens RN3-11-7 niaD-, обеспечивающиеполучение высокоактивных комплексных ФП с широкой специфичностью действия,обладающих различными видами протеолитической и гемицеллюлолитической активности.Проведено успешное внедрение технологии производства комплексных ФП и полученыпромышленные партии ФП с использованием новых рекомбинантных штаммов P. canescens –продуцентов протеаз и гемицеллюлаз в условиях завода ООО «Агрофермент» (Тамбовскаяобл.). На основании результатов лабораторных испытаний эффективности действия новых ФПна белоксодержащее растительное сырье показана перспективность примененияпротеолитического комплекса в спиртовой промышленности, а также в качестве кормовыхдобавок для сельскохозяйственных животных и птицы.Полученные результаты имеют большое практическое значение для осуществленияпромышленного производства отечественных ФП и обеспечения эффективногоимпортозамещения в пищевой промышленности и других отраслях АПК.Показана эффективность нового комплексного препарата, содержащего эндо- иэкзопептидазы, при сбраживании пшеничного сусла в производстве этанола в результатеинтенсификации процесса дрожжегенерации.Проведены успешные испытания промышленных партий комплексных ФП в условияхплемзавода «Орловский» (Тамбовская обл.) в составе комбикормов при откорме свиней.Показано положительное влияние кормовых добавок на продуктивность, физиологическоесостояние животных и качественные показатели мяса и шпика, а также на увеличение прибыли.Научно-практическая новизна технических решений подтверждена 2 патентами РФ.Основные положения диссертации, выносимые на защиту:1.