Диссертация (Клинико-биохимические изменения у животных при сочетанном введении левамизола), страница 11

Кондрахин, Н.В. Курилов, А.Г. Малахов,1985].Окраску мазков (рисунок 2.2.3) проводили по методу Романовского и Гимза. Мазоккрови выполняли на обезжиренном стекле ивысушивали на воздухе. Обезжиревание проводили в течение нескольких суток смесью Никифорова.Затем фиксировали мазок в смеси Никифорова (смесь этилового спирта 96 % инаркозного эфира в соотношении 1:1) в течение15 минут. Первичный краситель разводили всоотношении 1:13. Окраску проводили в течеРисунок 2.2.3. Мазки кровиние 40 минут, затем промывали мазок дистиллированной водой, высушивали и проводилиисследование под соответствующим объективом микроскопа с использованиемиммерсионного масла.

Выведение лейкограммы проводили способом меандров вчетырех условных зонах [Байматов В.Н., 2013].Исследования проводились на микроскопе биологическом рабочем«БИОЛАМ Р-11». Использовался окуляр К10х и различные объективы: 8, 40, дляработы с мазками крови использовался объектив МИ 90.2.2.6. Методы биохимического исследования кровиПроводились исследования следующих параметров: общий билирубин(мкмоль/л), прямой билирубин (мкмоль/л), общий холестерол (моль/л), глюкоза(моль/л), AЛT (ед/л), ACT (ед/л), мочевина (мкмоль/л), триглицериды (ммоль/л),общий белок (г/л), альбумины (г/л), глобулины (г/л).55Определение концентрации общего (прямого и неконьюгированного) билирубина в сыворотке крови проводили по принципу вступления его в реакциюазосочетания в присутствии диазотированного дихлоранилина.

Общий билирубин образует окрашенный в красный цвет комплекс азокрасителя в кислом растворе, интенсивность окраски которого прямо пропорциональна содержаниюбилирубина в пробе. Интенсивность окраски измеряется фотометрически придлине волны 546 нм.Прямой (коньюгированный) билирубин взаимодействует с диазотированной сульфаниловой кислотой с образованием окрашенного азосоединения.Интенсивность окраски азосоединения измеряется фотометрически при длиневолны 546 нм.Определение концентрации общего холестерола в сыворотке крови проводили энзиматическим колориметрическим методом. При гидролизе холестеролэстеразой эфиров холестерола образуется свободный холестерол. Образовавшийся и имеющийся в пробе холестерол под действием холестеролоксидазыокисляется кислородом воздуха с образованием перекиси водорода.

Перекисьводорода под действием пероксидазы окисляет хромогенные субстраты с образованием окрашенного продукта. При длине волны 500 (490-540) нм интенсивность окраски прямо пропорциональна концентрации общего холестерола в пробе.Определение концентрации глюкозы в сыворотке крови проводили энзиматическим колориметрическим методом без деспротеинизации. Под действиемфермента глюкозооксидазы бета-D-глюкоза окисляется до D-глюконолактона.При участии фермента пероксидазы образующаяся в данной реакции перекисьводорода способствует окислительному азосочетанию 4-аминоантипирина и фенола с образованием окрашенного соединения (хинониминовый краситель). Интенсивность окраски реакционной среды пропорциональна количеству глюкозыв исследуемом материале.

Интенсивность окраски определяется фотометрически.56Определение концентрации аланинаминотрансферазы в сыворотке кровипроводили кинетическим методом «АЛТ-UTS». АЛТ катализирует реакцию переноса аминогруппы с аланина на кетоглютарат, при этом образуются пируват иглютамат. Затем за счет окисления НАДН2 в присутствии лактатдегидрогеназы(ЛДГ) происходит восстановление пирувата до лактата. Скорость окисленияНАДН2 прямо пропорциональна активности АЛТ. Скорость окисления измеряется фотометрически при 340 нм.Определение концентрации аспартатаминотрансферазы в сыворотке крови проводили кинетическим методом «АСТ-UTS».

АСТ катализирует реакциюпереноса аминогруппы с L-аспартата на альфа-кетоглутарат, при этом образуются оксалоацетат и L-глутамат. Затем за счет окисления НАДН2 в присутствииМДГ происходит восстановление оксалоацетата до малата. Скорость окисленияНАДН2 прямо пропорциональна активности АСТ. Скорость окисления измеряется фотометрически при 340 нм.Определение концентрации мочевины в сыворотке крови проводилиферментативным кинетическим методом (уреазно-глутаматдегидрогеназный метод). Под действием уреазы происходит гидролиз мочевины до аммиака.

Затемпутем взаимодействия с 2-оксоглутаратом, катализируемого ферментом глутаматдегидрогеназой, происходит преобразование выделяющегося аммиака (ионоваммония) в L-глутамат. Результаты реакции регистрируют при длине волны 340нм.Определение концентрации триглицеридов в сыворотке крови проводилиGPO-PAP методом. В результате ряда реакций с исследуемой пробой образуетсяхинонимин.

Концентрация хинонимина пропорциональна концентрации триглицеридов в исследуемом образце. Концентрация хинонимина определяется фотометрически при длине волны 500 нм.Определение концентрации общего белка в сыворотке крови проводилибиуретовым методом. Белок с ионами меди в щелочной среде образует окрашенный комплекс. При длине волны 540 нм интенсивность окраски прямо пропорциональна концентрации общего белка в пробе.57Определение концентрации альбуминав сыворотке крови проводили колориметрическим методом с бромкрезоловым зеленым.Альбумин в кислой среде образует с бромкрезоловым зеленым комплекс, интенсивностьокраски которого прямо пропорциональнаконцентрации альбумина в пробе. Интенсивность окраски измеряется фотометрически придлине волны 540 (540-600) нм.2.2.7.

Исследования крови крыс методомспектроскопии ядерного магнитного резоРисунок 2.2.4. Спектрометр ядерногомагнитного резонанса 400-MR(Agilent, США, 2012 г.) с резонансной частотой 399,978 МГцнансаРабота проводилась на основе научноисследовательскойлабораторииЯМР-спектроскопии биомолекул на базе биологохимического факультета НИУ Белгородский Государственный Университет.В опыте использовались самцы белых лабораторных крыс средней массой 160 грамм.Животные содержались в клетках на опилках,при комнатной температуре, с хорошей вентиляцией, поение ниппельными поилками вволю,кормление зерновыми смесями.

Препарат левамизол вводили подкожно в дозе 11,3 мг/гол (70,6мг/кг). Взятие крови проводили методом гуманной декапитации животных в соответствии cРисунок 2.2.5. ПробоподготовкаЭтическим кодексом, утвержденным Международным советом медицинских научных обществ(CIOMS), и Хельсинкской декларацией Всемирной Медицинской Ассоциации.58Нами было создано восемь групп животных, у которых брали кровь через определенное время после введения препарата по схеме.Для каждой пробы 0,5 мл крови смешивалис 0,1 мл тяжелой воды с изотопной чистотой 99,95%.

Полученную смесь тщательно перемешивали ипомещали в специальные ампулы диаметром 5 мм(рисунки 2.2.5, 2.2.6). Одномерные1H ЯМР-спектры записывали на спектрометре ядерногомагнитного резонанса 400-MR (Agilent, США,2012 г.) с резонансной частотой 399,978 МГц (рисунок 2.2.6). Измерения проводились при постоРис. 2.2.6. Биоматериал в ампуледля ЯМР-спектроскопииянной температуре 298 K (25 оС). Перед каждымизмерением для достижения термодинамическо-го равновесия смеси образец выдерживался при данной температуре в течение 5минут. Анализ данных эксперимента проводили с помощью программного обеспечения VNMRj 3.1 и MestReNova 6.0.2.3. Результаты исследований2.3.1.

Исследование воздействия левамизола на низкоорганизованныеорганизмыДля первой серии опытов нами была выбрана модель с использованиемнизкоорганизованных организмов с целью изучения реакции на различные концентрации и сочетания препаратов у наиболее примитивных по структуре организации животных. Это дало нам первичную картину ответных реакций и позволило более точно сформировать дальнейшие этапы нашей работы.59Таблица 2. Реакция животных на нахождение в различных по концентрациирастворах левамизолаКонцентрацияВремялевамизогибели,ла вмин.растворе,мг/мл34NгруппыРастворлевамизола вводе, %121006020,757,5516,44±1,2731,515Реакциякольчатыхчервей5Собираются вгруппыМаленькиеособи потерялиактивность, убольшихособейспецифическиесудорогиГибель17,51±4,8751,32±7,220Судороги6,43±0,65Вытягивание вдлину и гибель2,2226Собираются вгруппы7Собираются вгруппыСнижениеактивностиСнижениеактивностиПотерялиактивность на80 %Потерялиактивность на90 %ГибельПроявляютминимальнуюактивностьГибель0Судороги2,53±0,66Вытягивание вдлину и гибель6,74±0,52РеакцияличиноккомаровсемействаChironomidaeГибель11,44±1,684Реакцияличинок мухсемействаCalliphoridaeСовершают маятникообразные движенияГибель,единичныесудорожныедвиженияПроявляютминимальнуюактивностьСовершают маятникообразные движенияГибельГибель60Рисунок 2.3.1.

Личинки и черви вводной среде(первая группа – контрольная)Рисунок 2.3.2. Личинки и черви в 0,75 %м растворе левамизола (вторая группа)Рисунок 2.3.3.Личинки и черви в 1,5 %м растворе левамизола (третья группа)Рисунок 2.3.4. Личинки и черви в 2,2 %-мрастворе левамизола (четвертая группа)Личинок и червей помещали в различные по концентрации растворы левамизола (таблица 2) объемом 100 мл и наблюдали за их поведением. Также личинок и червей помещали в раствор левамизола с добавлением различных аминокислот (таблица 3) и проводили наблюдения за их поведением.Минимальной устойчивостью к левамизолу обладают кольчатые черви,максимальной – личинки комаров семейства Chironomidae (таблица 2).

Хотякольчатые черви имеют родственные признаки с членистоногими (наличие постларвальной сегментации тела, особенности строения нервной системы), в данном случае можно наблюдать, что близкая родственная связь с нематодами, против которых направлено основное действие препарата левамизол, приводит кслабой устойчивости кольчатых червей к данному препарату. Реакция животныхна левамизол специфична: возникают внезапные и мощные сокращения всего61тела у кольчатых червей, у личинок комаров семейства Chironomidae появляютсямаятникообразные движения одной стороны тела (рисунки 2.3.1-2.3.4).Таблица 3. Реакция животных на нахождение в полуторапроцентном растворелевамизола с добавлением различных веществNгруппыВеществаВремягибели,мин.1Глюкоза 40 %,10 мл4,33±0,48РеакциякольчатыхчервейРеакция личинок мухсемействаCalliphoridaeСудороги,гибельГибельСудороги,затем вялыедвижения игибельГибель6,78±0,962Альфакетоглутаровая 4,08±0,56кислота, 0,2 г8,22±0,933Глицин, 0,2 г5,08±0,744Бета-аланин,0,2 г4,74 ±0,75Реакция личиноккомаров семействаChironomidaeМаятникообразныедвиженияГибельМаятникообразныедвиженияГибельСудороги,гибельСудороги,гибельГибельГибельГибельГибельПолученные данные показывают, что добавление к раствору левамизола40 %-й глюкозы и аминокислот вызывает гибель животных на 4,22 ± 0,34 минуты быстрей по сравнению с контролем (таблица 3).

Это явление объясняется тем,что глюкоза и аминокислоты всасываются предпочтительнее, но одновременно сэтим проникает и ангельминтик; и это ведет к быстрому отравлению и гибели.2.3.2. Экспериментальная модель изучения воздействия левамизола итетравита на белых мышейНами было сформировано семь групп мышей по 6 мышей в каждой (таблица 4). Животным вводились левамизол и тетравит в различных сочетаниях.Группа животных № 3 формировалась из животных, находящихся на голоднойдиете.