Диссертация (Бионаногибридные структуры на основе фоточувствительных мембранных белков – аналогов родопсинов животных), страница 12

Возбуждение осуществляли линией 514.5 нм аргонового лазера. Эта85линия хорошо перекрывается с полосой поглощения основного состояния БРD96N и способна запускать фотоцикл. Поскольку при стационарном освещениизеленым светом могут присутствовать все промежуточные формы БР-D96N, тодля изменения их относительного содержания мы использовали модулирующийсиний лазер с длиной волны 405 нм. Эта длина волны хорошо перекрывается сполосой поглощения М-формы БР-D96N, что позволяет инициировать быстрыйпереход белка в основное состояние. Описанный прием мы применили для оценкивлияния AgНЧ на параметры белка в ГКР активных областях.Для оценки влияния AgНЧ на БР-D96N вне этих областей использованметод флеш-фотолиза, позволяющий регистрировать изменения поглощения наразных длинах волн, соответствующих поглощению разных промежуточныхформ БР-D96N.

Это позволило оценить кинетические параметры образования ираспада отдельных интермедиатов фотоцикла БР-D96N.3.4.1 Исследование белка БР-D96N методом комбинационного рассеянияЗапись спектров КР проводили при стационарном возбуждении белка БРD96N излучением аргонового лазера с длинной волны 514,5 нм, что прищелочных значениях рН приводило к накоплению М-формы. Характернымспектральным признаком М-формы является линия 1566 см-1, которая доминируетв спектре КР при возбуждении зеленым лазером (рис 3.22а, спектр 2).

Включениемодулирующего синего (405 нм) лазера вызывает переход БР-D96N из М-формы восновное состояние. Это проявляется в изменении соотношения интенсивностейлиний 1566 см-1 (М-форма) и 1526 см-1 (основное состояние). Отношениеинтенсивности линии 1526 к интенсивности линии 1566 (I 1526 /I 1566 ) показываетколичество содержания формы БР-D96N. Изменения значения этого параметра взависимости от отношения мощностей возбуждающего и модулирующего лазеров(W 514.5 /W 405 ) совпадают с изменением значения отношения I 405ON /I 405OFF –интенсивности линии 1526 см-1 при включенном модулирующем излучении к86интенсивности той же линии при выключенном модулирующем лазере, рис.3.22б, кривые 2 и 1, соответственно.Надо отметить, что общий вид КР спектра БР-D96N, рис.

3.22а (спектры 1 и2) в целом совпадает со спектром КР БР дикого типа (БР-ДТ), рис. 3.22а (спектр3). Доминируют линии, соответствующие валентным колебаниям двойных C=C иC=N связей ретиналя (область 1500-1650 см-1), валентным колебаниям одинарныхС-С связей (1150-1200 см-1) и C-CH 3 (1008 см-1). В КР спектрах БР-D96N и БР-ДТcовпадают положения и относительные интенсивности линий деформационныхколебаний С-Н ретиналя (область 1250-1480 см-1).87Рисунок 3.22 - (a) Спектры комбинационного рассеяния БР-D96N (1, 2) и БР (3).Спектр (1) получен под облучением зеленого (514.5 нм) и синего (405 нм)лазеров, спектры (2) и (3) облучались только зеленым лазером; (б) влияниемодулирующего лазера на отношения интенсивностей линии 1526 см-1 привключенном (I 405 ON ) и при выключенном (I 405 OFF ) синем лазере и на отношениеинтенсивностей линий I 1526 /I 1566 в спектрах КР от соотношения плотностеймощности возбуждающего (W 514.5 ) и модулирующего (W 405 ) излучения в кювете вКР спектрах (1) и (2) и в ГКР спектрах (3).

Пунктиром показано отношениеI 1526 /I 1566 при выключенном модулирующем излучении.88Таким образом, отношение I 1526 /I 1566 может быть использовано в качествехарактерного параметра изменения содержания форм БР-D96N.3.4.2 Влияние модулирующего синего облучения на систему AgНЧ-D96NCпектры ГКР БР-D96N и БР-ДТ существенно отличаются (рис. 3.23,спектры 2 и 1, соответственно). В частности, спектр ГКР БР-ДТ содержитглавным образом линии валентных колебаний двойных (сильная линия 1528 см-1,валентные C=C колебания основной формы БР-ДТ) и одинарных связей атомовуглерода (1008 см-1 и 1163 см-1). В ГКР спектре БР-D96N валентные колебанияодинарных связей проявляются в виде слабой линии около 1163 см-1 и оченьслабой линии 1008 см-1. Зато усилены линии деформационных колебаний С-Н вобласти 1250-1450 см-1.

В области валентных колебаний двойных связей 15001650 см-1 БР-D96N присутствуют линии характерные для основного состояниябелка (1528 см-1), для М-формы (1568 см-1) и линия, соответствующая валентнымC=N колебаниям (1635 см-1). При этом, в отличие от БР-ДТ, в спектрах ГКР БРD96N все три линии имеют примерно равную интенсивность. Эти спектральныепризнаки указывают на значительное содержание депротонированной М-формымутанта БР-D96N.89Рисунок 3.23 - ГКР спектры свето-адаптированной формы БР (1) и БР-D96N (2), иразностный спектр свето-адаптированной формы минус темно-адаптированнаяформа БР-D96N (3) [7].В отличие от КР включение/выключение модулирующего синего излученияникак не влияет на вид спектров ГКР.

Это означает, что и в случае БР-D96Nнаблюдается тот же эффект, как и в случае БР-ДТ, эффект «замораживания»состояния белка в результате воздействия AgНЧ в ГКР активных областях.3.4.3 Роль свето-адаптированного состояния БР-D96N в фотоциклебелкаЧтобы оценить роль состояния, в котором находится белок в моментвзаимодействия с AgНЧ, мы использовали для инкубации с наночастицами БРD96Nвсвето-адаптированнойитемно-адаптированнойформах.Темно-адаптированная форма была получена путем выдерживания ПМ, содержащих БРD96N в темноте не менее 24 часов.

Инкубацию проводили также в отсутствии90света. На рис. 3.23 (кривая 3) приведен разностный спектр: светоадаптированнаяформа БР-D96N минус темноадаптированная форма БР-D96N. Изменениянаблюдаются в области деформационных колебаний C-H ретиналя и егометиленовых групп (1300-1500 см-1), а также в области валентных колебанийдвойных связей атомов ретиналя (1500-1650 см-1).

Изменения в области (13001500 см-1), по-видимому, связаны с изменениями во взаимодействиях междуретиналем и полипептидным окружением. Более информативной является областьвалентных колебаний двойных связей. Отрицательный сигнал в области 1528 см1, который указывает на то, что в темно-адаптированной форме белка в основномсостоянии больше, чем в светоадаптированной. Относительное содержание Мформы одинаково, на что указывает отсутствие изменений в области колебаний,соответствующих М-форме около 1568 см-1.

Положительный сигнал в областивалентных колебаний C=N указывает, что конформация депротонированногооснования Шиффа для этих двух случаев различна. Таким образом, показаназависимость формы в которой AgНЧ фиксируют БР-D96N от формы в которой оннаходился в момент связывания.Необходимо отметить, что различия в ГКР спектрах малы. Гораздо большиеразличия наблюдаются при сравнении ГКР спектров БР-ДТ и БР-D96N. СогласноданнымГКР,вГКРактивныхобластяхAgНЧфиксируютБР-ДТпреимущественно в основном состоянии.

В отличие от БР-ДТ, в результатевзаимодействия БР-D96N с AgНЧ, значительная часть молекул белка необратимопереходит в депротонированную М-форму. Следует отметить, что согласноданным спектроскопии поглощения в отсутствии света БР-D96N находитсяпреимущественно в основном состоянии. Переход и «замораживание» БР-D96N вдепротонированной М-форме является результатом воздействия AgНЧ в ГКРактивных областях. Таким образом, в конкуренции эффекта начального состояниябелка и модификации состояния в результате взаимодействия с AgНЧ, большеезначение имеет модификация, обусловленная воздействием наночастиц.913.4.4 Изменение кинетики фотоцикла белкаБР-D96N, индуцированноеAgНЧНа рис.

3.24 показаны результаты кинетических измерений изменениязначения поглощения БР на длине волны 410 нм, после запуска фотоциклакоротким световым импульсом (532 нм). Сопоставлены данные по влиянию AgНЧна фотоцикл мутантаБР-D96N (группа кривых 1-3) и БР дикого типа (кривые 4-6).В отличие от БР ДТ, для которого воздействие AgНЧ ускоряет фотоцикл, в случаемутантаБР-D96N фотоцикл существенно замедляется. Роль коагулянта в этомслучае сказывается не столь сильно.Рисунок 3.24 - Кинетические измерения полосы при 410 нм БР-D96N (1-3) и БР(4-6): только белок (1) и (4), белок инкубированный с AgНЧ (2) и (5), белок сAgНЧ инкубированный с коагулянтом (3) и (6) при рН раствора 9.2 [7].Суммируя можно заключить, что AgНЧ индуцируют процесс переходабелка в то состояние, в котором белок преимущественно фиксируется в ГКРактивных областях.

В случае БР-ДТ, это основное состояние. Переход в него92ускоряется присутствием AgНЧ. В случае мутанта БР-D96N, это М-форма. Здесь,наоборот, процесс распада М-формы замедляется.Таким образом, выявлен эффект влияния серебряных наночастиц AgНЧ намутантную форму фоточувствительного белка бактериородопсина БР-D96N,содержащегося во фрагментах пурпурных мембран. Показано, что AgНЧэффективно связываются с поверхностью ПМ. Это позволяет записать ГКРспектры БР-D96N. Обнаружено, что воздействие AgНЧ на БР-D96N в ГКРактивных областях, проявляется в замораживании фотоцикла белка. Фотоциклэтих молекул белка не инициируется и они не дают вклада в кинетическиеизмерения методом флеш-фотолиза.

На образцах свето-адаптированной и темноадаптированной форм БР-D96N выявлен слабый эффект влияния состояния белка,в котором он находился в момент связывания с AgНЧ на вид фиксированнойнаночастицей формы БР-D96N. Существенно большую роль играет изменениесостояния БР-D96N, индуцированного наночастицей. Обнаружено, что AgНЧ вГКР-активных областях способны не только изменять, но и «замораживать»измененное состояние БР-D96N. Это объясняется тем, что в результатевоздействия AgНЧ в ГКР-активных областях увеличивается содержаниедепротонорованной М-формы белка БР-D96N.93Заключение1.Проведено сравнительное исследование свойств фоточувствительныхмембранных белков бактериородопсина и БР-D96N в различных условиях среды.2.Созданы фотовольтаические структуры на основе ориентированногослоя БР и различных электродов.

Максимально эффективной была определенаструктура PET-ITO-о., где максимальные значения фотопотенциала при временах0,01 - 0,001 секунд на 12-14% выше, чем в стандартной системе PET-ITO.3. Получены неориентированные бионаногибридные структуры пурпурныхмембран с квантовыми точками (ПМ–КТ 570 ) в суспензии, характеризующиесяувеличением скорости образования (рост поглощения 40 ±1 μс) и распада Мформы (снижение поглощения 4,9±0,2 мс).4.Получены ориентированные бионаногибридные структуры ПМ-КТ 570в электрофоретически осажденных пленках. Данные комплексы характеризуютсязначительным увеличением скорости образования (рост фотопотенциала 205±1μс) и распада М-формы (снижение фотопотенциала 306±50 мс) по сравнению соструктурой без КТ.5.Обнаружено наличие двух областей сильного и слабого воздействиянаночастиц серебра (AgНЧ) на БР и белок БР-D96N:5.1. В результате сильного взаимодействия БР фиксируется в томсостоянии, в котором он находился в момент связывания с AgНЧ.