Диссертация (Бионаногибридные структуры на основе фоточувствительных мембранных белков – аналогов родопсинов животных), страница 8

Одним из достижений работы [25] явилосьобнаружение трех факторов, улучшающих параметры данного процесса в жидкойэлектрохимической ячейке. Во-первых, авторам удалось улучшить разделениеносителей зарядов при фотоактивации системы в растворе путем замены обычнойпористой мембраны на протон-селективную мембрану «Nafion» (Рис. 1.15а).Рисунок 1.15 - Характеристики протон-селективных мембран и наночастицразной формы. (а) Фототок, генерируемый нативным бактериородопсином (БР)при использовании пористой мембраны (зеленый) и мембраны «Nafion» (черный).Стационарный ток усиливается за счет протонной селективности мембраны«Nafion». (б) Изображения, полученные с помощью ПЭМ: 1 — сферы, 2 —кубоиды-А с сильно усеченными углами, 3 — кубоиды-Б с незначительноусеченными углами, 4 — идеальные кубы.

(Масштаб — 100 нм). Адаптировано из[92].47Во-вторых, авторам удалось максимально сохранить плазмонный эффектполя за счет использования поливинилпирролидона (PVP) с ММ=55 кДа длясоздания ультратонкого полимерного покрытия наночастиц, которое минимальноуменьшает электромагнитное поле, сохраняя при этом высокую временнуюстабильность наночастиц по сравнению с частицами, покрытыми другимиполимерами с разными молекулярными массами. В-третьих, авторы использовалиспециально синтезированные наночастицы заданной формы (Рис.

1.15б),наилучшие из которых существенно повышали мощность плазмонного поля (Рис.1.16а) и ширину спектрального перекрытия их абсорбции по сравнению с таковойдля М-формы (Рис. 1.16б). Авторы также разработали элегантную теоретическуюмодель для объяснения следующего выдающегося результата эксперимента, когдав электрохимической ячейке с мембраной «Nafion», содержащей БР и плазмонныенаночастицы (заданной формы и размера), фототок достигал величины порядка210 нА•см-2 (Рис. 1.16в, г) [92].48Рисунок 1.16 - Графики дипольной аппроксимации, спектры поглощениянаночастиц серебра и фотовольтаические свойства бактериородопсина (БР).

(а)Графики дискретной дипольной аппроксимации трехмерных электрических полейдля серебряных сфер 40 нм в диаметре (справа) и серебряных кубов с длинойребра 40 нм (слева). Графики свидетельствуют о сильном электромагнитном полеу частиц кубической формы. (б) Спектры поглощения серебряных сфер, кубоидови кубов размером 40 нм, покрытых поливинилпирролидоном (ПВП) с ММ=55кДа, показывают уменьшение спектрального перекрытия с M-формой БР(заштрихованная область) с увеличением заостренности углов у частиц.

(в)Генерация фототока БР под воздействием синего света повышается благодарячастицам серебра (40 нм), покрытым ПВП с ММ=55 кДа. Усиление фототоканативного БР (кривая 1) с использованием сфер (кривая 2), кубоидов-А с оченьусеченными углами (кривая 3), кубоидов-B с мало усеченными углами (кривая 4),и идеальных кубов (кривая 5).

(г) Плотность фототока БР для наночастиц разной49формы (черные столбики), спектральное перекрытие полосы поверхностногоплазмонного резонанса наночастиц и M-формы БР (кривая 1) и степеньзаостренности углов у частиц серебра в качестве индикатора напряженности поля(кривая 2). Адаптировано из [92].Авторы заявили, что это почти в 5000 раз выше, чем в ранееопубликованных данных по фототоку в электрохимических ячейках, содержащихтонкие БР-пленки, что вызывает у нас некоторые сомнения.

Действительно,фототок для неориентированных слоев БР дикого типа существенно меньшеуказанного выше (обычно он составляет 1-3 нA•см-2, но может быть увеличен до4-6 нA•см-2 после удаления липидов из образцов БР [65]). В принципе, величиныфототока для пленок БР могут быть даже выше 20 нA•см-2 при достаточновысоком напряжении (500 мВ) в случае некоторых мутантных штаммов БР.

Онибыли получены, например, в работе [65], где метионин (в положении 163) былзаменен на цистеин для обеспечения ориентированного связывания БР споверхностью золотого электрода. С другой стороны, мы уже цитировали вышеряд работ по электрохимическим ячейкам с ЛБ-пленками, имеющими большоечисло полиэлектролитных слоев, чередующихся с БР (дикого типа илимутантным), в которых величины фототоков составляли от 100-200 нA•см-2 [24,41, 42] до 420 нA•см-2 [50]. В пленках ПМ-ЛШ эта величина колебалась от 50 до200 нA•см-2 [55], а в случае ПМ-БЛМ пленок — от 100 до 150 нA•см-2 [45].

Такимобразом, указанные величины фототоков сопоставимы [24, 41, 42, 45, 55] стаковыми, приведенными в работе [92], или даже гораздо больше [50].Хотя до настоящего времени эффективные пленочные нанобиогибридныесистемы КТ/БР еще не вышли на коммерческий рынок, но их большоепотенциальное значение иперспективность для применения втехникепродемонстрирована на вышеуказанных примерах. Таким образом, предложенныев данном обзоре подходы и методы служат основой для создания новыхпленочных нанобиогибридных систем (прежде всего КТ/БР), эффективностькоторых будет выше, чем у существующих сейчас материалов.50ГЛАВА 2.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ2.1 ПМ, суспензии с КТ и пленочные структурыПурпурные мембраны были получены из H. salinarum по стандартнойметодике [20, 56]. Схема изоляции пурпурных мембран представлена на рисунке2.1. Концентрация дисперсии ПМ была 6 мг/мл, что было определенопосредством измерения оптической плотности раствора при 570 нм (молярныйкоэффициент экстинкции 63000 М-1см-1). ПМ, как правило, используются чаще,чем чистый БР, поскольку отделение БР от ПМ значительно уменьшает какбиохимическую, так и термодинамическую стабильностью белка.51Рисунок 2.1 - Схема выделения ПМ [56].Длясозданияиспользоваласьфотовольтаическойсмесьпроводящегоэтилендиокситиофен):поли(стиролсульфонат)нано-гибриднойструктурыплимераполи(3,4-(ПЭДОТ:ПСС)(приобретеноCLEVIOS™ P VP AI 4083), которая являлась приэлектродным слоем (рис.

2.2).52Рисунок 2.2 - Структурная формула ПЭДОТ:ПСС.Нанесение водорастворимой полимерной смеси ПЭДОТ:ПСС (массовоесоотношение 1:6) на PET-ITO-электрод проводилось методом вращающейсяподложки - «spin coating» (2000 об./мин.).Ориентированную пленку ПМ получали электрофоретическим осаждениемиз предварительно очищенной диализом водной суспензии ПМ между двумяэлектродами (Ni и ITO) при воздействии электрического поля 2 В. Пурпурныемембраны ориентированно осаживаются цитоплазматической отрицательнозаряженной стороной на положительный ITO-электрод [47].Изменения в поглощения света ПМ были измерены с помощьюлабораторнойустановкифлэш-фотолизасдвойноймонохроматизациейзондирующего пучка и возбуждения с помощью лазера Nd: YAG (532 нм, 8 нс, 15мДж). Пленки на основе фрагментов ПМ или их смесей с КТ 570 были получены напрозрачном проводящем электроде (PET-ITO) с помощью электрофоретическогоосаждения, как описано ранее выше для суспензии ПМ.

Ni фольга былаиспользована для второго (верхнего) электрода, который был плотно прижат кгладкой поверхности ориентированных пленок ПМ.В работе использовались квантовые точки структуры ядро/оболочкаCdSe/ZnS, излучающие на длинах волн 470, 540, 570 и 640 нм. Данные КТ были53солюбилизированы,т.е.ихгидрофобныелигандыбылизамененынаполи(этиленгликоль) как описано ранее [19, 80].

Интенсивность флуоресценции ивремя жизни КТ были измерены с помощью спектрофлоуриметра FLUOROLOG-3(Horiba Jobih Yvon) с опцией TCSPC. Все измерения проводили в 100 мМ натрийфосфатном буферном растворе, содержащем 100 мМ KCl (рН 7,5). Всестандартные химические вещества аналитической чистоты были приобретены уSigma-Aldrich.2.2 Получение золя AgНЧСеребряный боргидридный золь синтезировали восстановлением нитратасеребра боргидридом натрия в водной среде [6, 70]. Краткое описание метода: 12мл раствора боргидрида натрия концентрацией [NaBH 4 ] = 0,076 мг/мл охлаждалсядо t = 00 С, затем при интенсивном перемешивании добавлялись 4 мл растворанитрата серебра концентрацией [AgNO 3 ]= 0,17 мг/мл. Синтезируемые такимобразом AgNPs контролировали методами динамического светорассеяния иатомно-силовой микроскопии. Средний размер AgNPs составил 24 нм, разброс подиаметру на полувысоте пика распределения не превышал 7 нм.

Максимум пикапоглощения золя находисля на длине волны 395 нм. Для активации золя иформирования «горячих точек», золь обрабатывали перхлоратом натрия.Образованиеассоциатовконтролировалипопоявлениюдлинноволновойсоставляющей в спектре поглощения на длине волны около 480 нм.2.3 Контроль геометрических параметров нанообъектовДля контроля размеров микро- и наночастиц (фрагментов ПМ, частицсеребряного золя, квантовых точек) и использовали метод динамическогосветорассеяния.

Измерения проводили на приборе 90 Plus Particle Size Analyzer,Brookhaven Instruments Corporation. Измерения проводили в водной среде.Усреднениепо6измерениямпо10секунд.Измеренияразмеров54солюбилизированных КТ и их ζ-потенциала проводили методом динамическогорассеяния света на приборе Zetasizer Nano ZS, Malvern Instruments.Геометрию фрагментов ПМ и распределения на них AgNPs измерялиметодом АСМ на приборе, зондового микроскопа Ntegra (НТ-МДТ) вполуконтактной моде на воздухе.2.4 Запись спектров КР и ГКРДля регистрации спектра использован монохроматор Solar TII MS50004I сCCD детектором.

Мощность синего модулирующего излучения (405 нм) в кювете– 12 мВт. Мощность возбуждающего (514 нм) регулировали в диапазоне от 0 до200 мВт. Время накопления сигнала выбирали в диапазоне от 10-160 с,усреднение по 10 измерениям для каждого спектра.КР спектры ПМ записывали при концентрации 3 мг/мл раствора воде, длязаписи ГКР спектров использовали 0,3 мг/мл раствор ПМв воде, которыйсмешивали в соотношении 25 мкл/25 мкл с боргидридным золем серебра иинкубировали 5 минут (оптимальное время инкубации), после чего добавляли 5мкл 1 ммоль/мл водного раствора перхлората натрия для коагуляции частиц золя.Полученные растворы помещались в кювету объемом 60 мкл.В зависимости от условий освещения БР может находиться разныхсостояниях. При освещении БР дикого типа постоянным светом в полосу егопоглощения будет наблюдаться равновесие между интермедиатами фотоцикла сосмешением в сторону основной темновой формы, так как возврат в исходноесостояниепроисходиточеньбыстро,всегозанесколькомиллисекунд.Стационарное световое равновесие различных форм коррелирует со временами ихжизни.ПосколькувсеосновныеинтермедиатыфотоциклаБРфоточувствительны, то облучение светом с длиной волны, соответствующейопределенной форме, индуцирует быстрый переход из нее в основное состояние.В частности, облучение БР синим лазером приводит к быстрому переходу БР изМ-формы (максимум поглощения 412 нм), образовавшейся при начальном55облучении желто-зеленым лазером, в основную форму.

Таким образом,использование дополнительного лазера позволяет контролируемо изменятьсоотношение промежуточных форм БР, а также изучать влияние на этосоотношение внешних факторов, в частности, воздействия AgNPsС этой целью, в настоящей работе была создана установка с двумя лазерамиориентированными так, что излучение направлялось в кювету с образцом спротивоположных сторон, а сигнал КР регистрировался в перпендикулярном кним направлении [64]. Для возбуждения спектра использовали аргоновый лазер«PLASMA LGN-519M», отрегулированный на длину волны 514,5 нм. Длямодуляции соотношения промежуточных форм БР использовали диодный лазер.Длины волны диодного модулирующего лазера была выбрана 405 нм, чтопозволяет резонансно модулировать переход из М-формы (максимум поглощения412 нм) в основное состояние.2.5 Флеш-фотолизФотореакции бактериородопсина исследовали на методом флеш-фотолиза[84] импульсном однолучевом дифференциальном спектрофотометре с двойноймонохроматизацией измеряющего света.