Диссертация (1151496), страница 3
Текст из файла (страница 3)
1.3).15Рисунок 1.3 - Схематическое изображение монослоев и ленгмюровских пленок. (I)Жидко-растянутое состояние нативных и денатурированных мембранных белкови липидов; (II) Жидко-конденсированное состояние мембранных белков; (III)Метод переноса монослоев Ленгмюра-Блоджетт (вертикальный); (IV) Методпереноса монослоев Ленгмюра-Шефера (горизонтальный). Адаптировано из [96].Площадь, приходящаяся на молекулу БР, в монослое (при экстраполяции кдавлению 0 мН•м-1) на поверхности 100 мМ раствора КСl составляет порядка 8 нм[57], что хорошо согласуется с данными рентгеноструктурного анализа белка вмембране (ячейка с размерами 2.5×3.5×4.5 нм) [43].
Именно резкий подъем визотерме поверхностное давление – площадь (на молекулу белка) и высокоедавление коллапса монослоя (более 45 мН•м-1) свидетельствуют об образованиидостаточно прочных монослоев БР на концентрированных солевых субфазах.С другой стороны, не вызывают доверия количественные данные поплощади на молекулу БР (порядка 4000-5000 Å2/БР), полученные из изотерм16зависимости поверхностного давления от площади для монослоев ПМ в работеFuruno T., Sasabe H [32]. Сами авторы данной работы [32] считают, что такиеплощади более чем в 4 раза превышают максимально возможные площади длянативного БР во фрагментах ПМ и, скорее всего, соответствуют развернутойконформации БР при среднем значении площади на аминокислотный остаток,составляющем15Å2.ЗначительнаяденатурацияБР(выраженнаявразворачивании полипептидной цепи) может быть связана как с использованиемводно-органическойсмесирастворителейдлясуспендированияБРипоследующего нанесения на поверхность 0.2 мМ раствора CaCl 2 при рН 6.4, так ис длительным временем инкубации монослоя ПМ на границе раздела фаз — от 30минут до 5 часов [32].Исследованиювлиянияразличныхэкспериментальныхусловийнаструктуру и ориентацию ряда мембранных белков в монослоях на границераздела вода воздух посвящено много работ, в том числе, уже цитированныхвыше [32, 48, 54, 88, 96].
Наиболее детально эти важные эффекты впервые былиисследованымощнымметодомполярзационно-модулированнойИК-спектроскопии в работах [48, 67]. Путем сравнения полос в области 1655 см-1(полоса амида I) и 1545 см-1 (полоса амида II) при измерении ИК-спектровпоказано, что БР сохраняет нативную структуру, а зрительный родопсин частичноденатурирует в монослое при указанных выше условиях и 20°С [67].Дополнительным свидетельством такой денатурации явилось появление плечапри 1634 см-1, что соответствует появлению большего числа β–складок, иуменьшение интенсивности полосы 1655 см-1, соответствующей α-спиральнымструктурам в родопсине [48, 67]. Минимальная степень денатурации зрительногородопсина наблюдалась при его нанесении на указанную выше солевую субфазу вбольшом количестве (150 мкл), которое давало начальное давление 5 мН•м-1 принизких температурах (вплоть до 4°С) [48, 67].
Однако в данной работе стабильныемонослои белков получали на 100 мМ растворах NaCl и 10 мМ фосфатном буфере(pH 7.2) или 40 мМ карбонатном буфере (pH 9.0) путем нанесения 10-5 Мдисперсии зрительного или бактериального родопсинов с нулевым начальным17давлением и выдерживали до сжатия 30 или 50 мин., соответственно [67], чтоявляется, по нашему мнению, избыточным временем. Такое длительное времявыдерживания монослоя ПМ (БР) до начала его сжатия приводит не столько кформированию адекватного слоя ПМ, сколько к нарушениям в упаковкемембранных агрегатов и даже к частичному разворачиванию трехмернойструктуры БР (Рис.
4, правая часть схемы I). Важным экспериментальным фактом,соответствующим параметрам природной среды для всех типов белков, являетсяприсутствие (во всех случаях) 100-150 мМ NaCl в водной субфазе длястабилизации монослоя ПМ, БР или зрительного родопсина, поскольку вотсутствие данных солей никаких изотерм этих белков на границе разделавода/воздух зарегистрировать не удалось даже при большом количестве белка.Такимобразом,главнымдостижениемвышеописанныхработявляетсяопределение условий, при которых нативная структура мембранных белковсохраняется после формирования их монослоя. В целом, БР является наиболеестабильным из всех изученных родопсинов, денатурацию которых на границераздела фаз очень сложно предотвратить.
Для визуализации таких структурныхпереходовиспользуюттакойсовременныйметод,какмикроскопияБрюстеровского углового рассеяния (БУМ). Например, методом БУМ в работе [2]удалось показать, что БР сохраняет свою доменную организацию в монослоенепосредственно после нанесения на водный раствор 100 мМ КСl, а нераспределяется по поверхности даже при низких значениях давления (менее 0.1мН•м-1). Вскоре после начала сжатия монослоя (при давлениях выше 1.0 мН•м-1)эти домены начинают сливаться между собой, образуя сплошную фазу на всемпротяжении монослоя БР [2].
Одновременные исследования методом атомносиловой микроскопии (АСМ) монослоев БР, перенесенных на графитовыеподложки методом Ленгмюра-Блоджетт, подтвердили доменную структурумонослоя БР с толщиной порядка 5 нм. Все указанные выше данные полностьюсоответствуютизвестнымструктурнымособенностямнативныхмембранпурпурных бактерий [16, 40, 44, 46, 61, 78], что свидетельствует о сохранениинативной структуры и функции этих мембранных белков после формирования их18монослоя и возможности создания различных типов планарных систем на ихоснове для научных и технических целей.Для создания заданных типов мультислойных структур (называемых такжеленгмюровскими пленками) на основе ПМ для научных и технических целей, какправило, используется ЛБ-метод переноса указанных выше монослоев с границыраздела вода/воздух на специальные твердые подложки [5, 72, 86].
Эта методикахорошо отработана для различных ПАВ и белков, а основные результаты поспектральным и фотоэлектрическим свойствам ЛБ-пленок ПМ были, как правило,получены и обсуждены в тех же работах, где рассматривались их монослои [2, 88,96].О функциональной нативности БР свидетельствуют и значительныевеличины фотопотенциала, описанные для мультислойных структур на основе БРпри освещении светом в полосе, близкой к максимому поглощения этого белка(порядка 570 нм) [3, 44, 60, 87].С другой стороны, в работах японских авторов из Ashigara ResearchLaboratories, Fuji Photo Film Co, Ltd. [55] монослои ПМ, полученные принанесении смеси вода:гексан:ДМФ (диметилформамид) в соотношении 10:10:2,былиперенесеныметодомЛенгмюра-Шеффера(ЛШ)(аналогичноизображенному на Рис.
4, схема IV) при постоянном поверхностном давлении 20мН•м-1 на поверхность SnO 2 электрода. Важно, что интенсивность в спектреполученных пленок при 560 нм (в области максимума поглощения БР) былапропорциональначислуперенесенныхЛШ-монослоев(от2до10)скоэффициентом наклона 0,002 на монослой [55]. В случае переноса 6 монослоевПМ на поверхность SnO 2 электрода величина фототока составляла от 50 нА•см-2(рН 4-5 или 8-10) до 200 нА•см-2 (рН 6-7) [55], что показывает высокуюэффективность данного типа переноса для создания мультислойных структур наоснове ПМ.
Аналогичные ЛБ- и ЛШ-пленки из монослоев ПМ и БР описаны вряде других работ.Таким образом, на основании всех рассмотренных данных можно выделить2 общих типа структур моно- и мультислоев ПМ или БР (Рис. 4, структуры III иIV), подходящих по своим параметрам для технологических приложений.19Указанные типы систем можно считать предшественниками нанобиогибридныхструктур, поскольку они состоят из принципиально различных компонентов(органическойслойнанеорганическомматериале),наноразмерны,функциональны и молекулярно интегрированы на границе раздела фаз.1.1.3 Пурпурные мембраны, адсорбированные на черных липидныхмембранах и липидных бислоях других типовБольшое число работ за последние 30 лет было выполнено в областиполучения и исследования пленок ПМ, адсорбированных на бислойных (черных)липидным мембранах (БЛМ) и подобных мембраноподобных подложках, которыепредставляют собой своеобразные «димерные» слои, состоящие из бислоялипидов, на котором находится БР-липидный слой [27, 28, 33, 45, 83].
Такиесистемы можно получить рядом методов, простейшим из которых являетсяследующий «двухэтапный» способ: а) «самосборка» БЛМ из капли растворазаданной смеси липидов на микронном отверствии в тефлоновой перегородкемежду двумя растворами электролитов (как правило, 100 мМ NaCl с 5 мМ ТрисHCl при рН 7.0); б) последующее внесение ПМ в один из растворов электролитовмикрошприцем (50 мкл из суспензии с оптической плотностью 4-5) с постепеннойадсорбцией в течение 20-40 минут на указанную БЛМ (рис. 1.4а).20Рисунок 1.4 - Схематическое изображение пурпурных мембран, адсорбированныхна нано-бислойных липидных мембранах (нано-БЛМ) (а) и электрическаяэквивалентная схема фотоактивированного бактериородопсина,адсорбированного на нано-БЛМ, DPhPC - 1,2-дифитаноил-глицеро-3-фосфохолин,DPPTE - 1,2-дипальмитоил-глицеро-3-фосфотиоэтанол натриевая соль, ODA –октадециламин; (б).
C m и R m — емкость и сопротивление нано-БЛМ; С р и R p —емкость и сопротивление пурпурных мембран; I p — фотоуправляемый протонныйток, генерируемый бактериородопсином. В условиях короткого замыканияпадение напряжения на мембране (V m ) равно таковому на пурпурной мембране(V p .). I — измеряемый ток.
Адаптировано из [45].Считается, что в таком случае ПМ адсорбированны периплазматическойстороной на БЛМ, причем достигается высокая степень ориентации ПМ с21транспортом протона из среды на БЛМ. Однако конкретных значений для степениориентации ПМ или подобных количественных характеристик, являющихсяключевыми величинами для гибридных нано-биоструктур, ни в одной изизвестных в этой области работ не приводится. Удивительно, что в подобныхсистемах авторы не наблюдают или, по крайней мере, не обсуждают возможноевстраивание ПМ в БЛМ, особенно учитывая наличие достаточно большого числамолекул липидов в структуре ПМ.
Однако косвенным указанием на возможностьтакого рода «перестройки» двух бислоев в один «смешанный» бислой являетсясущественное уменьшение величин фотопотенциалов, регистрируемых придлительных экспериментах в таких системах. Существует большое число болееранних модификаций указанного выше метода получения системы ПМ на БЛМ,среди которых можно выделить адсорбцию ПМ (реже — везикул очищенного БРили его мутантных штаммов) на липид-импрегнированные фильтры, тонкиеколлоидные или тефлоновые пленки. В целом, для характеристики свойств такихсистем используются традиционные схемы регистрации изменений тока илипотенциала (Рис. 1.4б), возникающих при облучении пленки светом в видимойобласти.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
