Диссертация (1151496), страница 2
Текст из файла (страница 2)
Полученные данные обработаны -на ПКпо стандартным методикам с помощью программ глобального фитирования,Origin, GRAMS, математические методы обработки статистических данных.Личный вклад соискателя. Все этапы работы, включая разработкуметодик, проведение экспериментов, обработку и анализ полученных результатовбыли проведены лично автором или при его непосредственном участии.Степень достоверности и апробация работы.Достоверность полученных результатов обусловлена тем, что: а) весь объемэкспериментальной работы выполнен на сертифицированном оборудовании, былапоказана воспроизводимость научных результатов (каждое измерение выполненоне менее 3 раз); б) результаты, полученные автором, согласуются слитературнымиданнымииданными,представленнымивнезависимыхисточниках по данной тематике; в) экспериментальные данные обработаны сприменением современных компьютерных программ.Основные материалы диссертации были доложены и обсуждены на:международном семинаре «Nano-Bio Hybrid Materials with Photovoltaic and EnergyTransfer Properties» (Реймс, Франция, 2012); 9 международном симпозиумеаспирантов «Horizons in Molecular Biology» (Геттинген, Германия, 2012); третьеммеждународном симпозиуме «Molecular Photonics» (Санкт-Петербург, Россия,2012); третьем Российско-Греческом симпозиуме Bionanotox-2012 «Biomaterialsand bionanomaterials: recent problems and safety issues» (Греция, 2012); шестоймеждународной конференции по синтетической биологии «SB6.0: The SixthInternational Meeting on Synthetic Biology» (Лондон, Великобритания, 2013);международноммастер-классе«LaserPhysics»(Прага,Чехия,2013);международной конференции SPIE Nanophotonics V (Брюссель, Бельгия, 2014);международной конференции «Science of the Future» (Санкт-Петербург, Россия,2014); 1-ой Международной Школе-конференции «Saint–Petersburg OPEN 2014»(Санкт-Петербург, Россия, 2014); Международной научной конференции побиоорганической химии, биотехнологии и бионанотехнологии, посвященной 55-8летию Института биоорганической химии им.
академиков Ю.А.Овчинникова иМ.М.Шемякина РАН и 80-летию со дня рождения академика Ю.А.Овчинникова(Москва, Россия, 2014); международной конференции «Nanomeeting 2015»(Минск, Беларусь, 2015); международной конференции «Advances in FunctionalMaterials Conference 2015» (Stony Brook University, США, 2015).Опубликованные результаты. По теме диссертации опубликовано 15печатные работы: 13 статей (в том числе 12 - в изданиях, рекомендованных ВАКРФ), 18 тезисов докладов.Структура и объем диссертации. Материалы диссертации изложены на106 страницах машинописного текста, в том числе включают: 42 рисункав, 3таблицы. Диссертация состоит из разделов: введение, обзор литературы,материалы и методы, результаты и их обсуждение, заключение, условныеобозначения и сокращения, библиографический список.
Список использованнойлитературы включает 97 источников, в том числе 88 зарубежных.9ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ1.1Системынаосновефрагментовпурпурныхмембранифоточувствительных мембранных белков - родопсинов1.1.1 Структурно-функциональные особенности бактериальных изрительных родопсиновРодопсины—этомембранныесветочувствительныебелки,обеспечивающие трансмембранное разделение заряда («протонный насос») припоглощении кванта света. Такое свойство используется для широкого рядаважнейших биологических функций животных и бактерий [16, 40, 43, 44, 46, 61,79, 90].
Молекулярные структуры трех важнейших ретиналь-содержащих мембранныхбелков (зрительный родопсин; бактериородопсин, галородопсин) достаточно сходны иполучены с атомным разрешением [4, 79]. Бактериородопсин (БР) являетсянаиболее доступным и имеет оптимальные свойства для технологическогоприменения [16, 40, 44, 46, 48, 60, 61, 87, 90]. Простота выделения БР связана сего концентрированием в доменах «пурпурных мембран» (ПМ) (Рис.
1.1) хорошоизученной галофильной бактерии — Halobacterium salinarum [9–11].10Рисунок 1.1 - Схематическое изображение структуры бактериородопсина (а),адаптировано из [46], и основных интермедиатов его фотоцикла с максимумамипоглощения (б), адаптировано из [38].Полипептидная цепь БР состоит из 248 аминокислот (ММ ~26500 Да),изогнутаиобразуетсемьтрансмембранныхα-спиралей(Рис.1.1),пронизывающих бислой плазматических мембран бактерий. Указанные семь αспиралей образуют две «арки»: внешнюю арку из спиралей E, F, G, A ивнутреннюю арку из спиралей B, C, D.
Структура и конформационные измененияБР были изучены методом электронной кристаллографии с разрешением 0.32 нм вплоскостимембраныи0.36нмповертикали[79].Поданнымэлектронографического и рентгеноструктурного анализа [43, 79], пурпурныемембраныпредставляютсобойгексагональнуюдвумернуюрешетку,элементарная ячейка которой включает 3 молекулы белка и 12-14 молекуллипидов, причем такая мембрана асимметрична. Только структура из трехмолекул белка как единого функционального элемента позволяет образоватьтрансмембранную пору. На каждую молекулу белка приходится хромофор(ретиналь), химически пришитый к лизину 216 в спирали G посредством11основания Шиффа.
После воздействия кванта света происходит изомеризацияретиналя из транс- в цис-конформацию (all-trans → 13-cis), что соответствуетпереходу из основного состояния с λ max 570 нм (БР 570 ) в М-форму с λ max 412 нм(М 412 ) (см. Рис. 1.1б), а обратный переход в фотоцикле белка связан с переносомпротона из цитоплазмы через мембрану во внешнюю среду. Подобнаятрансформация из основного состояния получила название – фотоцикл БР.Фотоцикл включает в себя циклический переход из основной формы поддействием света через несколько промежуточных форм (интермедиатов) обратнов основную. Каждая промежуточная форма фотоцикла поглощает светопределенной длины волны и переходит в следующую форму за определенноевремя (около 12 мс) [9].
Каждая переходная форма в фотоцикле обозначаетсялатинской буквой, как правило, с индексом длины волны поглощения света, т.е.B 568 , J 600 , K 590 , L 550 , M 412 , N 560 , O 640 , P 490 , Q 380 , кроме того, существует темновая(темно-адаптированная) форма D 548 (рис. 1.1б).Наиболее важные для биотехнологического использования особенности БР(при его фотоактивации): изменение максимума поглощения с 570 до 412 нм иобратно (переход из основной формы в M 412 и обратно); генерация фототока ифотопотенциала; изменение pH внутри и вне клеток или модельных липосом засчет векторного переноса протона; возможность многократного проведения всехуказанных выше процессов без денатурации белка; доступность и относительнаяпростота получения препаратов, содержащих БР в нативном состоянии.Помимо дикого типа БР распространено применение мутантной формыбактериородопсина – белка БР-D96N.
В БР-D96N аспарагиновая кислота (Asp) вположении 96 заменена на непротонирующийся аспарагин (Asn). В природномбелке (БР дикого типа) Asp-96 выполняет функцию донора протона, обеспечиваябыстрое протонирование основания Шиффа ретиналя и возврат его в основноесостояние из М-формы.
При отсутствии донора Asp-96 репротонированиеоснования Шиффа происходит непосредственно протоном из внешней среды, врезультате чего время жизни депротонированной М-формы возрастает нанесколько порядков [68].12Таким образом, БР в составе ПМ является уникальных мембранным белком,преобразующим физическую энергию (кванты света) в химическую энергию(макроэргические связи молекул АТФ) и механическую энергию (например,движение жгутиков бактерий), что делает его перспективным компонентомфункциональных планарных систем.1.1.2 Монослои и пленки Ленгмюра-Блоджетт и Ленгмюра-ШефераМонослои из ПМ или из очищенных белков типа бактериального илизрительного родопсинов представляют собой наиболее яркие и хорошоописанные примеры модельных мембранных систем [3, 16, 17, 40, 44, 46, 48, 61,90].
Следует подчеркнуть, что БР обладает замечательными физико-химическимисвойствами и соединяет в себе три главные молекулярные функции, ключевыедляфундаментальныхисследованийитехническогоприменения:фотоэлектрическая, фотохромная и протон-транспортирующая [16, 40, 44, 46, 61,90]. Для этих целей ПМ используются чаще, чем БР, поскольку его выделение изэтих «кристаллоподобных» мембранных структур значительно уменьшает какхимическую, так и термодинамическую стабильность белка.
Асимметрияцитоплазматической (внутренняя) и периплазматической (внешняя) поверхностейПМсущественнадляпониманиявозможностисамопроизвольногоориентирования (до определенной степени) ПМ на границе раздела жидкость/газ.В первых экспериментах в лаборатории Стоккениуса по получениюмонослоев ПМ их, в чистом виде или в смеси с соевым лецитином, наносили награницу раздела жидкость/газ из раствора в гексане (как наиболее удобномнеполярноморганическомрастворителе);затемэтаметодикабыламодифицирована для других органических растворителей и смесей органическихрастворителейиводы(большоечислотакихпервоначальныхданныхсуммированы в монографии [3]).
В ряде работ [32, 96] было показано, что ПМчастично денатурируют при смешении органических растворителей с воднойсубфазой,чтоможетбытьсвязанокаксразрушениемгидрофобных13взаимодействий внутри белка, так и с исключением из его трехмерной структурымолекул липидов. В большинстве случаев наиболее перспективным являетсяметод получения монослоев ПМ или БР при их нанесении из водных дисперсий[96]. Поскольку БР является достаточно гидрофобным белком, то неудивительно,что он, даже без добавления специальных липидов, способен образовыватьотносительно стабильные монослои на границе раздела фаз.
Обнаружено, что ПМпреимущественно ориентируются цитоплазматической (внутренней) стороной вводную субфазу, и при переносе монослоев ПМ на гидрофильные подложкипорядка 85% ПМ были адсорбированы в ориентации цитоплазматическойстороной мембраны к поверхности стекла [88].Необходимо отметить, что, среди большого числа работ по этой теме,параметры монослоев ПМ или БР количественно описаны только в нескольких[32, 54, 88], причем наиболее достоверными являются данные, приведенные вобзорных работах [54]. Из данных работы [54] следует, что изотерма длямонослоя ПМ на 100 мМ NaCl (Рис. 1.2) имеет небольшой перегиб в области 20мН•м-1 и область коллапса при 46 мН•м-1.
Как поверхностный потенциал, так и«коэффициент сжатия» монослоя пурпурных мембран имеют максимум в этой жеобласти (около 20 мН•м-1) при площади порядка 5 нм2 на молекулу БР [54]. Этипараметры, по мнению авторов, соответствуют максимально плотной упаковкеПМ в монослое. Это подтверждают иизмерения толщины монослоя,составляющей около 3.8 нм [48, 54] (при поверхностных давлениях ниже 35 мН•м), что практически соответствует размеру гидрофобных α-спиралей ПМ [79].114Рисунок 1.2 - Изотермы поверхностного давления (Π), обратного сжатия (1/KS) иповерхностного потенциала (∆V) монослоя пурпурных мембран на поверхности100 mM NaCl.
Адаптировано из [17].При более высоких давлениях, особенно вблизи области коллапса монослоятолщина пленки увеличивается до 5.1 нм, что авторы [48] объясняютпостепенным образованием второго слоя над уже сформированным монослоемПМ. По нашему мнению, этот эффект связан с переходом молекул БР вполностью вертикальное положение относительно поверхности раздела фаз:схематически такой переход может соответствовать переходу трехмерныхструктур I в II (Рис.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
