Диссертация (Бионаногибридные структуры на основе фоточувствительных мембранных белков – аналогов родопсинов животных), страница 11

Изображение ПМ с адсорбированнымисеребряными наночастицами представлены на рисунке 3.17.76Рисунок 3.17 - АСМ изображение ПМ с AgНЧ.Использовалась система – коагулированный серебряный золь, хорошозарекомендовавший себя при получении спектров ГКР. Серебряный зольполучали восстановлением нитрата серебра боргидридом натрия в водной среде.В результате формировались частицы со средним диаметром 24 нм. Золькоагулировали добавлением перхлората натрия как в отсутствии, так и вприсутствии фрагментов ПМ. Показано, что в отсутствии фрагментов ПМ,формируются ассоциаты, что регистрируется по появлению длинноволновогопика в спектре поглощения в области около 480 нм. В противоположность этому,присутствие фрагментов ПМ подавляет формирование ассоциатов.

По даннымспектроскопии поглощения, количество ассоциатов в этом случае составляетлишь 5-6% от количества ассоциатов, образующихся в отсутсвии фрагментов ПМ.Поскольку количество ассоциатов в какой-то мере отражает количество ГКРактивных участков (так называемых «горячих точек»), можно предполагать, чтоэто ограничит фактор усиления ГКР.77Запись спектров КР проводили при возбуждении излучением аргоновоголазера с длинной волны 514,5 нм.

Длина волны возбуждения частичноперекрывается с полосой поглощения основного состояния БР. Поэтомуизлучениевозбужденияиндуцируетстартфотоциклаиобусловливаетприсутствие в образце всех промежуточных форм БР. Поскольку коэффициентыэкстинкции основных промежуточных форм близки между собой, можно ожидатьчто вклад в сигнал КР будет примерно пропорционален временам их жизни.Наиболее долгоживущими являются промежуточные M- и О-формы (2 мс и 10 мс,соответственно), можно полагать, что кроме основной, в спектрах КР будутпроявляться именно эти формы.В спектрах КР ПМ, представленных на рис. 3.18 а, кривые 1 и 2,доминируют линии, соответствующие резонансному возбуждению ретиналя [58].К ним относятся группа линий в области 1500-1650 см-1, связанная с валентнымиколебаниями двойных связей С=С и С=N (1640 см-1) [75, 77], группа линий вобласти 1150-1200 см-1, соответствующая валентным колебаниям одинарныхсвязей С-С основной цепи ретиналя и относительно сильная линия 1008 см-1,связанная с валентными колебаниями С-СН 3 , при атомах углерода С 9 и С 13(нумерация атомов ретиналя приведена на вставке рис.

3.18а).Кроме того, в спектре наблюдаются ряд слабых линий в области 1270-1440см-1, вызванных деформационными колебаниям С-Н основной цепи ретиналя идвух его боковых метиленовых групп.78Рисунок 3.18 - (а) КР (1, 2) и ГКР (3) спектры БР: (1) и (3) облучение толькозеленым лазером (514.5 нм), (2) облучение зеленым и синим (405 нм) лазерами;вставка – схема и нумерация атомов молекулы ретиналя; (б) зависимостьотношения интенсивностей линии 1526 см-1 при включенном (I405 ON) и привыключенном (I405 OFF) модулирующем синем лазере от соотношенияплотностей мощности возбуждающего (W514.5) и модулирующего (W405)излучения в кювете в КР спектрах (1) и ГКР спектрах (2) .Воздействие второго модулирующего синего лазера индуцирует быстрыйпереход БР из М-формы в основную, минуя промежуточную О-форму.Содержание основной формы увеличивается, условия резонансного возбужденияулучшаются.

Это проявляется в увеличении интенсивности спектра КР и, вчастности, линии 1526 см-1, интенсивность которой при равных плотностяхмощности возбуждающего и модулирующего излучений увеличивается более,чем в 2.5 раза. Фактор увеличения интенсивности линии 1526 см-1 уменьшается сростомотношениямощностивозбуждающегоизлучениякмощностимодулирующего и стремиться к единице в отсутствии модулирующего излучения,рис. 3.18.б, кривая (1). Фактор изменения интенсивности этой линии можетиспользоваться в качестве индикатора влияния AgНЧ на БР. Характерные линиидля различных форм фотоцикла БР представлены в таблице 3.79Таблица 3 - Отнесения линий КР и ГКР для форм фотоцикла бактериородопсина.КР, см-1ГК, см-11004mФормаBR568, M,, OОтнесениеC-CH 3 , str1010mBR5481167m1167sBR548, OC10-C11, str1195s1195wBR568, M, OC14-C15, strBR568C8-C9, str2014sh1271w1271wC-H, def(осн.цепи)все1299w1370w1370w1400wC-H, def(метилен.

групп)1440w1450w1526vsBR5681536vs1566mBR548M-форма1580wC=C, strBR5681592w1620w1640mM-форма1640mвсеC=N, strОбозначения интенсивности линий: w – слабая, m – средней интенсивности,s – сильная, vs – очень сильная, sh – плечо. Колебания: str – валентные, def –деформационные.803.3.1 Влияние модулирующего синего облучения на систему AgНЧ-ПМПрименяемый модулирующий (синий, 405 нм) лазер о приводит к быстромупереходу БР из М-формы (максимум поглощения 412 нм), образовавшейся приначальном облучении зеленым лазером, в основную форму.

Таким образом,использование дополнительного лазера позволяет контролируемо изменятьсоотношение промежуточных форм БР. На рис. 3.18а, спектр (3) приведен спектрГКР фрагментов ПМ. Как и в случае КР, спектры носят резонансный характер.Сравнение со спектрами ГКР так называемых «белых» мембран, то есть мембран,в которых отсутствует хромофор, показывает, что сигнал ГКР определяетсяисключительно ретиналем. Фактор усиления ГКР составляет лишь 15, что, повидимому, связано с малым числом ГКР-активных областей.По сравнению с КР спектрами, в ГКР спектрах ПМ наблюдается смещениелинии валентных колебаний C=N от 1640 см-1 к 1630 см-1 и усилениеинтенсивности линии 1563 см-1.

Оба признака указывают на повышенноесодержание депротонированной М-формы ретиналя. Наблюдается заметноеперераспределение интенсивности линий, связанных с валентными колебаниямиодинарных связей С-С. Подавляются колебания связей С 8 -С 9 и С 14 -С 15 .Интенсивными остаются валентные колебания центральной части молекулыретиналя С 10 -С 11 . Кроме того, появляется интенсивная линия 933 см-1,характерная для деформационных внеплоскостных колебаний С-Н групп,указывающая на наличие торсионных искажений молекулы ретиналя.Принципиальным является тот факт, что спектр ГКР БР практически независит от включения и выключения модулирующего лазера, что указывает наотсутствие изменений состояния БР при воздействии на нее модулирующегоизлучения. Небольшое изменение интенсивности сигнала при включении синеголазера при малых значениях отношения мощности возбуждающего лазера кмощности модулирующего излучения, показанное на рис.

3.18б, кривая 2, связанос вкладом КР, составляющего примерно 1/15 долю сигнала.Полученный результат означает, что AgНЧ в ГКР-активных областяхпрактически полностью подавляют фотоцикл БР.813.3.2 Свето- и темно-адаптированные формы бактериородопсина всистеме AgНЧ-ПМРис. 3.19 представляет спектры фрагментов ПМ, инкубированных с AgНЧ вразличной начальной форме. Спектр (1) на рис. 3.19, соответствует случаю, когдабыла использована светоадаптированная форма, содержащая как основную формуБР 568 , так и небольшие количества М-формы (М 412 ) и О-формы (О 640 ). Кривая (2)получена при использовании для инкубирования так называемой темновой формыПМ.

Для получения последней, ПМ по крайней мене 24 часа выдерживались втемноте. Инкубацию проводили также в отсутствии света. Известно [77], чтотемновая форма BR 548 содержит примерно равные количества двух форм: всетранс, идентичную основной форме BR 568 и протонированную 13-цис, C=N цисформу (рис. 3.20).Рисунок 3.19 - ГКР спектры БР: свето-адаптированная (1) и темноадаптированная (2) формы, разница спектров (1) и (2).82Рисунок 3.20 - Структура фотохрома бактериородопсина в темно-адаптированномсостоянии и во время фотоцикла. Адаптировано из [66].Особенностью темновой формы является положение полосы поглощения смаксимумом на 548 нм, смещение и изменение относительной интенсивностинескольких линий в спектре КР: линия валентных колебаний двойной связи C=Cсмещена от 1526 см-1 (форма BR568) к 1536 см-1 (BR548); линия валентныхколебаний связи N=C смещена от 1640 см-1 (BR568) к 1634 см-1 (BR548), линиясредней интенсивности около 1170 см-1 в спектре BR568 уменьшается ипредставлена слабой линией 1167 см-1 в спектре BR548.Все перечисленные признаки проявляются в разностном спектре: ГКРспектр светоадаптированной формы минус ГКР-спектр темноадаптированнойформы, рис.

3.19 кривая(3). Положительные сигналы около 1154 и 1519 см-1указывают на большее содержание фиксированной all-транс в случае инкубацииAgНЧ со светоадаптированной формой БР. Отрицательные сигналы около 1539 и831629 см-1 - на большее содержание 13-цис, C=N цис формы фиксированной приинкубацииAgНЧстемноадаптированнойформойБР.Крометого,положительный сигнал в разностном спектре около 1567 см-1 указывает наприсутствие некоторого количества М-формы, фиксированной при инкубацииAgНЧсПМвсветоадаптированнойформе,ноотсутствующейвтемноадаптированной форме БР.В целом, полученные результаты показывают, что инкубация ПМ с AgНЧприводит к фиксации молекулы БР в том состоянии, в котором она находилась вмомент начального взаимодействия с наночастицей.

Время жизни фиксированнойформы состояние белка зависит от мощности излучения, активирующей ГКР, влюбом случае, при длительном воздействии лазерного излучения на системуAgНЧ-БР, белок денатурирует.3.3.3 Изменение кинетики фотоцикла бактериородопсина,индуцированное AgНЧНа рис. 3.21 показаны результаты кинетических измерений изменениязначения поглощения БР на длина волны 410 нм, после запуска фотоциклакоротким световым импульсом (532 нм). Приведены данные для БР, БРинкубированного с AgНЧ и после обработки коагулянтом (перхлорат натрия).Полученные результаты показывают, что кроме областей, в которых фотоцикл БРподавлен серебряными наночастицами и, поэтому, не дает вклада в кинетическиеизмерения, есть области слабого воздействия. Общей тенденцией являетсяуменьшение времени жизни М-формы в результате воздействия серебряныхнаночастиц.84Рисунок 3.21 - Кинетические измерения полосы полощения при 410 нм БР (1), БРинкубированный с AgНЧ (2) и БР с AgНЧ инкубированный и коагулянтом (3).В данном разделе показано, что в результате адсорбции AgНЧ на ПМ,формируется небольшое количество ГКР активных областей, в которыхнаночастицы принципиально изменяют свойства БР.

В этих областях фотоциклБР практически полностью подавлен. БР «замораживается» в том состоянии, вкотором он находился в момент связывания с AgНЧ. Кроме этих областей,присутствуют области слабого воздействия AgНЧ на ПМ, в которых БР сохраняетспособность осуществлять фотоцикл. Воздействие AgНЧ приводит к ускорениюфотоцикла за счет ускорения перехода БР из М формы в основное состояние.3.4 Влияние наночастиц Ag на свойства белка БР-D96N: исследованияметодами комбинационного и гигантского комбинационного рассеянияВ данном разделе описано изучение методами КР и ГКР спектроскопииэффектов воздействия серебряных наночастиц на фотоцикл мутанта БР-D96N.Как и в предыдущем разделе 3.3, серебряные наночастицы выполняют двефункции: объекта исследования в системе БР-D96N/AgНЧ и зонда для полученияэффекта ГКР.