Диссертация (Бионаногибридные структуры на основе фоточувствительных мембранных белков – аналогов родопсинов животных)

Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждениевысшего образования «Московская государственная академия ветеринарноймедицины и биотехнологии – МВА имени К.И. Скрябина»На правах рукописиСоловьева Дарья ОлеговнаБИОНАНОГИБРИДНЫЕ СТРУКТУРЫ НА ОСНОВЕФОТОЧУВСТВИТЕЛЬНЫХ МЕМБРАННЫХ БЕЛКОВ –АНАЛОГОВ РОДОПСИНОВ ЖИВОТНЫХ03.01.04-биохимия03.01.06 – биотехнология (в том числе бионанотехнологии)Диссертация на соискание ученой степеникандидата биологических наукНаучные руководители:доктор биологических наук,доктор химических наук, профессорЗайцев Сергей Юрьевичдокторфизико-математических наук,Олейников ВладимирАлександровичМосква - 20172ОГЛАВЛЕНИЕВВЕДЕНИЕ ...................................................................................................................... 4ГЛАВА 1.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ ................................................................................ 91.1 Системы на основе фрагментов пурпурных мембран и фоточувствительныхмембранных белков - родопсинов ................................................................................. 91.1.1 Структурно-функциональные особенности бактериальных и зрительныхродопсинов ....................................................................................................................... 91.1.2.

Монослои и пленки Ленгмюра-Блоджетт и Ленгмюра-Шефера ................... 121.1.3. Пурпурные мембраны, адсорбированные на черных липидных мембранах илипидных бислоях других типов ................................................................................. 191.1.4. Самоассоциация и послойная сборка пурпурных мембран ............................ 241.1.5. Электрофоретическое осаждение и седиментация пурпурных мембран ...... 281.2. Гибридные нано-биоматериалы на основе пурпурных мембран ...................... 32ГЛАВА 2.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ...................................................................... 502.1. ПМ, суспензии с КТ и пленочные структуры ..................................................... 502.2 Получение золя AgНЧ ............................................................................................ 532.3 Контроль геометрических параметров нанообъектов .........................................

532.4 Запись спектров КР и ГКР ...................................................................................... 542.5 Флеш-фотолиз.......................................................................................................... 55ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ .....................................................

573.1. Взаимодействие пурпурных мембран с различными электродами ипроводящим полимером в фотовольтаической ячейке ............................................. 573.2. Взаимодействие пурпурных мембран с квантовыми точками на границераздела фаз ..................................................................................................................... 643.3. Влияние металлических наночастиц на свойства бактериородопсина:исследования методами комбинационного и гигантского комбинационногорассеяния ........................................................................................................................ 7433.3.1 Влияние модулирующего синего облучения на систему AgНЧ-ПМ ............. 803.3.2 Свето- и темно-адаптированные формы бактериородопсина в системе AgНЧПМ ................................................................................................................................... 813.3.3 Изменение кинетики фотоцикла бактериородопсина, индуцированное AgНЧ.........................................................................................................................................

833.4. Влияние наночастиц Ag на свойства белка БР-D96N: исследования методамикомбинационного и гигантского комбинационного рассеяния ............................... 843.4.1 Исследование белка БР-D96N методом комбинационного рассеяния ........... 853.4.2 Влияние модулирующего синего облучения на систему AgНЧ-D96N .......... 883.4.3 Роль свето-адаптированного состояния БР-D96N в фотоцикле белка ........... 893.4.4 Изменение кинетики фотоцикла белкаБР-D96N, индуцированное AgНЧ .... 91Заключение ....................................................................................................................

93УСЛОВНЫЕ ОБОЗНАЧЕНИЯ И СОКРАЩЕНИЯ................................................... 94БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК ......................................................................... 964ВВЕДЕНИЕАктуальность. Создание и структурно-функциональное исследованиесупрамолекулярных систем на основе фоточувствительных мембранных белков инаноструктурявляетсяперспективнойиактивноразвиваемойзадачейсовременной биохимии, биотехнологии и физико-химической биологии [11, 63,71,В96].частности,необходимоотметитьхорошоизвестныйфоточувствительный белок бактериородопсин (БР), содержащийся в пурпурныхмембранах (ПМ) галофильных бактерий Halobacterium salinarum и являетсяаналогом зрительных родопсинов животных. Наличие хромоформной части –ретиналя в комплексе с белком опсином позволяет использовать энергию светадля активного перемещения протона через мембрану в результате фотоцикла БР.Для увеличения эффективности передачи световой энергии на белок могутиспользоваться различные наночастицы типа полупроводниковых квантовыхточек(КТ)илиметаллическихнаночастиц.Формированиегибридныхнаноструктур на основе БР (ПМ) с наночастицами или позволяет создавать новыенано-биоматериалы с заданными свойствами для биохимии, биотехнослогии,сенсорики и фотоники.

Однаковлияние разных типов наночастиц набиологические наноструктуры типа БР до сих пор описаны не полностью.Разработка гибридных наноструктур требует модификации свойств белка, котораяпозволяетуправлятьиоптимизироватьэффектывзаимодействияБРснаночастицами, наноструктурированными и полупроводниковыми средами.Детальное исследование эффеков взаимодействия белка с неорганическимиструктурами позволит направленно конструировать бионаногибридные системы.Цельработы:комплексноеисследованиефоточувствительныхмембранных белков - аналогов родопсинов животных - и создание на их основебионаногибридных структур с заданными свойствами.Исходя из этой цели, были поставлены следующие задачи:1.Сравнитьсвойствафоточувствительныхмембранныхбактериородопсина и БР-D96N в различных условиях среды.белков52.

Создать фотовольтаический элемент на основе ориентированного слоя БРи исследовать влияние проводящего полимера и нескольких типов электродов насвойства БР.3. Оценить влияние солюбилизированных полупроводниковых квантовыхточек на фотоцикл БР в суспензии и ориентированной бионаногибриднойструктуре.4. Определить характеристики фотоциклов белков БР и БР-D96N привзаимодействии с наночастицами серебра.Научная новизна. Найдены эффекты влияния квантовых точек нафотоцикл БР в суспензии, охарактеризованы скорости образования и распадаосновного интермедиата фотоцикла БР – М-формы. Определена возможностьрегулированияпараметровфотоциклаБР,предложенасхемауказанныхбиохимических и биофизических процессов.

Впервые получены ориентированныепленки ПМ с квантовыми точками характеризующиеся увеличением скоростиобразования и распада М-формы – основного интермедиата фотоцикла БР.Исследовано взаимодействие металлических наночастиц с мембранами напримере воздействия серебряных наночастиц (AgНЧ) на пурпурные мембраны.Обнаружено, что ПМ подавляют коагуляцию серебряного золя, необходимую дляформирования активных областей гигантского комбинационного рассеяния(ГКР). Впервые показано, что воздействие AgНЧ подавляет фотоцикл БР в ГКРактивных областях связывания с AgНЧ.

В областях слабого воздействия AgНЧ наБР происходит ускорение фотоцикла и ускорения распада М-формы. Такжеисследовано влияние AgНЧ на мутантную форму бактериородопсинаБР-D96N ипоказано, что процесс распада М-формы замедляется.Теоретическая и практическая значимость полученных результатов.Разработана модель позволяющая оценить эффекты влияния наночастиц набиологические структуры и использовать для создания бионаногибридныхструктур,которыехарактеристиками.Вобладаютчастности,оптимизированнымивозможностьуправляемымирегулированияфотоциклабактериородопсина за счет различных неорганических структур дает возможность6направленно конструировать наногибридные системы, например наносенсоры.Гибридные наноэлементы обеспечат "наноразрешение" для применения вбиомолекулярной электронике, оптическом переключении и фотовольтаике засчет преимуществ их размера, эффективности свето- и электро-контролируемыхфункций, надежной структуры, стабильности и низкой стоимости производства.Результаты работы внедрены в учебный процесс ФГБОУ ВО МГАВМиБМВА им.

К.И. Скрябина для обучения бакалавров и магистров по дисциплинам«Избранные главы биохимии», «Супрамолекулярные биохимические системы вбиологии мембран». Часть работ данной диссертации проводили в течениевыполнения гос. контракта № 11.G34.31.0050 в рамках Государственнойподдержки научных исследований, проводимых под руководством ведущихученых в российских образовательных учреждениях высшего профессиональногообразования.Основные положения, выносимые на защиту:1. Свойства фоточувствительных мембранных белков бактериородопсина иБР-D96N закономерно изменяются в зависимости от условий среды.2. Параметры фотовольтаического элемента на основе ориентированногослоя БР; влияние полимера и электродов на свойства элемента.3.

Влияние солюбилизированных полупроводниковых квантовых точек нафотоцикл БР в суспензии и ориентированной бионаногибридной структуре.4. Характеристики фотоциклов белков БР и БР-D96N при взаимодействии снаночастицами серебра.Методология и методы проведенных исследований.В ходе выполнения исследования применялись методы и подходы, хорошозарекомендовавшие себя в ходе предыдущих работ по созданию и исследованиюгиборидных наноструктур. Основные примененные методы: сканирующаязондовая микроскопия, в частности атомно-силовая микроскопия в контактноймоде, комбинационное и гигантское комбинационное рассеяние, динамическоерассеяние света, абсорбционная спектроскопия, флуоресцентная спектроскопия,электрофоретическая седиментация, инфракрасная спектроскопия, флеш-фотолиз7на импульсном однолучевом дифференциальном спектрофотометре с двойноймонохроматизацией измеряющего света.