Автореферат (Взаимоотношения геномной ДНК и липидов - влияние факторов окружающей среды), страница 7

10).βАРПКцАМФЛиполизα2АРДНКиРНКАнтилиполизАктивация системырепарацииРис. 10. Регуляция через систему адренорецепторов функционирования репарационнойсистемы (мутагенез, антимутагенез) и липолиза. АР ˗ адренорецептор, ПК ˗ протеинкиназа.«По механизму действия эта система полирецепторна, то есть в ней принимаютучастие представители различных типов рецепторов (α- и β-АР), и поливалентна, тоесть и стимуляторы (эпинефрин, фенилэфрин, орципреналин) и блокаторы(пророксан, пропранолол) рецепторов участвуют в формировании клеточногоантимутагенеза» (Гайнуллина, 2000; Ибрагимова и др., 2011; 2014).33ЗАКЛЮЧЕНИЕДанное диссертационное исследование выполнено в рамках малоизученнойтемы взаимоотношения геномной ДНК и липидов и влияния на них фактороввнешнего воздействия среды (Дьячков и др., 2011; Жданов и др., 2014а,б,в; 2015;Ибрагимова и др., 2012а,б; 2013; 2014а; Тарасов и др., 2012).Все поставленные в настоящей работе задачи выполнены.

Впервые проведеноисследование структуры и свойств комплексов между липидами и ДНК; определеновлияние на них факторов среды (температура, фазы роста, лекарственные препараты)для изучения взаимосвязи нестабильности геномной ДНК и модуляторов липидногообмена.Впервые нами проведена сравнительная характеристика жирнокислотныхмаркеровобщихлипидовграмположительнойBacillussubtilisOSU_142играмотрицательной Pseudomonas aurantiacа В-1558 бактерий в зависимости отвлияния факторов внешнего воздействия – температуры (от 24 до 39 оС) и фазы роста(логарифмическая, стационарная). Предложено использовать в качестве маркера фазыроста Bacillus subtilis величину отношения 15:0 антеизо / 17:0 антеизо кислот, а вкачестве температурного маркера для Bacillus subtilis – величину отношения 15:0изо/17:0 изо, а для Pseudomonas aurantiacа – соотношение содержания 16:0 / 18:1ω7cкислот (Жданов и др., 2012; Ибрагимова и др., 2012а). Показано, что основнымикомпонентами жирнокислотного профиля ДНК-связанных липидов препаратагеномной ДНК Pseudomonas aurantiaca, выделенного детергентным методом,являются кислоты 16:0 и 18:0 (Жданов и др., 2012).

Определены жирные кислоты илипиды, входящие в состав прочно- и слабосвязанной с ДНК фракции липидов.Предложен новый способ качественного и количественного анализа липидов,прочносвязанных с геномной ДНК, на который получен патент. Данный способпозволяет определить жирнокислотный состав ДНК-связанных липидов, которыеостаются после независимой обработки ДНК гидролизующими ферментами (илиДНКазой I, или РНКазой А, или протеиназой К).

Анализ липидов включаетследующие основные стадии: 1) выделение из клеток ДНК, с которой связаны липидынадмолекулярногокомплекса,спомощьюдетергентов;2)гидролизДНК(супрамолекулярного комплекса: ДНК, РНК, белки и липиды) гидролизующимиферментами; 3) выделение липидов, определение их жирнокислотного состава спомощьюгазовогохроматографа.Предложенныйспособопределенияжирнокислотного состава ДНКсвязанных липидов может быть использован при34разработкеновыхметодовдиагностикизаболеванийпожирнокислотному(липидному) составу ДНК˗связанных липидов пациента или создании новых типовлекарственных средств (Жданов и др., 2014а).Комплексы ДНК и клеточных мембран прокариот были известны с 1970-хгодов. Ученым ещё предстоит исследовать функции большого разнообразия липидовклеточного ядра (Albi, Magni, 2004; Alesenko, Burlakova, 2002). Специалисты,выделявшие препараты геномной ДНК, знают, как много там содержится липидов икак трудно от них избавиться.

Большинство липидов удаляется фенольнойобработкой, которая, однако, может привести к артефактам, связанным с переносомна ДНК мембранных липидов. Липиды хроматина частично связаны непосредственнос ДНК (Стручков, Стражевская, 1993), часто настолько прочно, что даже послевыделения геномной ДНК в присутствии детергентов ее образцы содержат липиды,как это показано для геномной ДНК прокариот (Zhdanov et al., 2006). Роль ДНКсвязанных липидов в функционировании хроматина и ядра необходимо изучать болеедетально, однако определенные результаты уже получены. В частности, известенфакт увеличения количества ДНК-мембранных контактов у микроорганизмов,выделенных из воды, охлаждающей атомные энергетические установки, получившихназвание Microccocus (Deinococcus) radiodurans. Таким образом, микробы защищаютсвой геном от ионизирующего излучения образованием комплексов ДНК смембранами.

Широко известно изучаемое и обсуждаемое сейчас биологическоедействие малых доз радиации (Бурлакова и др., 2003). Один из парадоксов здесьзаключается в том, что они могут вызывать значительные повреждения геномнойДНК. Одно из объяснений этому явлению заключается в том, что ионизирующееизлучение действует сначала на двойные связи ДНК-связанных липидов иинициирует образование свободных радикалов, которые и разрушают ДНК in situ(Стручков, Стражевская, 1993).

Остается актуальным для исследований вопрос о ролилипидов в передаче сигнала и регуляции экспрессии генов (Wassarman, Wolffe, 1999),хотя в этой области накоплено достаточно данных о регуляции экспрессии геновполиненасыщенными жирными кислотами (Kamath-Loeb et al., 2014). Известно, вчастности,чтополинасыщенныежирныекислоты(ПНЖК),линоленовая,арахидоновая и эйкозапентаеновая кислоты являются ингибиторами пролиферацииклеток.В настоящем исследовании представлен подход к изучению липидного составаДНК-связанных липидов прокариотической клетки методом масс-спектрометрии с35использованием электроспрей ионизации (ESI-LC-MS).

Впервые обнаружено, что дляобеих фракций ДНК-связанных липидов характерно наличие фосфатидилглицерина,фосфатидилсеринаилизо-фосфатидилинозитола.Вслабосвязанной(спирторастворимой) фракции ДНК-связанных липидов могут содержаться такжефосфатидилхолин и фосфатидилинозитол, а во фракции прочносвязанных липидов –триацилглицериды и кардиолипин.В работе обсуждена специфичность взаимодействия жирных кислот ифосфолипида с ДНК и показаны особенности их расположения в малой бороздкеДНК, исходя из их структурных особенностей (Дьячков и др., 2011; Жданов и др.,2014в; Тарасов и др., 2012). Согласно нашим представлениям специфичность липиднуклеиновых взаимодействий может выражаться в существовании ДНК-липидныхвзаимодействий, в которых жирные кислоты (липиды) связываются с ДНК взависимости от нуклеотидной последовательности.

Это обстоятельство может игратьважную роль при рассмотрении вопросов регуляции экспрессии генов, передачисигнала и стабилизации определенных участков генома, в частностиCG-динуклеотидных повторов в некодируемых областях генома. Оно может бытьважным и при исследовании передачи сигнала от клеточной мембраны в геномнуюДНК, поскольку липиды там уже имеются, а важным классом медиаторов передачисигнала являются гидрофобные молекулы липидной природы. В стабилизациикомплекса жирной кислоты и ДНК важную роль играют водородные связи, ван-дерваальсовы и гидрофобные взаимодействия, что было нами продемонстрировано вэкспериментах in silico (Дьячков и др., 2011; Жданов и др., 2014в; Тарасов и др., 2012;Michanek et al, 2012).Результаты наших компьютерных экспериментов согласуются с предложеннойнами концепцией о том, что существующие в препаратах геномной ДНКпрочносвязанныелипиды,взаимодействующиеснейвзависимостиотпоследовательности нуклеотидов, могут составлять новый информационный уровеньгеномной ДНК (Жданов и др., 2014в; Тарасов и др., 2012).

Также нами полученобóльшее значение энергии связи для связывания линолевой кислоты с ДНК, чем длясвязывания олеиновой кислоты (Дьячков и др., 2011), которая используется дляполученияфосфолипида-помощникадиолеилфосфатидилэтаноламина.Такимобразом, для получения более высокой эффективности при переносе генов вгенотерапии перспективнее использовать липид-помощник с остатком линолевой, ане олеиновой кислоты (Тарасов и др., 2012).Нами было установлено, каким образом разные лиганды адренорецепторовчерез модификацию аденилатциклазной системы, которая является мессенджером36(посредником) в реализации самых разнообразных биохимических процессов сучастием липидов, влияют на развитие генетического стресса.