Автореферат (1151324), страница 2
Текст из файла (страница 2)
А. Гумбольдта «Наука и политика вXXI веке: новые импульсы международного сотрудничества» (Пенза, 2007); 11-йМеждународной Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология – наукаXXI» (Пущино, 2007); Seminars of Chair of Genetics and Bioengineering, YeditepeUniversity (Стамбул, Турция, 2007, 2008); II Международной научно-практическойконференции «Постгеномная эра в биологии и проблемы биотехнологии» (Казань,2008); 12-й Международной Пущинской школе-конференции молодых ученых(Пущино,2008);XIVВсероссийскойнаучно-практическойконференциисмеждународным участием «Молодые ученые в медицине» (Казань, 2009); Internationalon-line Internet Conference «Fundamental Medicine: from Scalpel – to Genomics,Proteomics, Lipidomics», devoted to 50th Anniversary of 1961 Nobel Prize for DNA doublehelix (Казань, 2011); III Международной научно-практическойконференции«Биоэлементы.
Научные основы и опыт применения биоэлементов» (Оренбург, 2011);Cell Symposium «Genetics and Chemistry Sharing a Language of Discovery» (Кембридж,США, 2012); IV Российском съезде биофизиков (Нижний Новгород, 2012); II RussianFrench Symposium on Chemo-and Bioinofrmatics (Казань, 2012); Международнойнаучной интернет-конференции «Биоинформатика и молекулярное моделирование»(Казань, 2012); III Международной научной онлайн-конференции «Актуальныепроблемы биохимии и бионанотехнологий» (Казань, 2012); III Международнойнаучно-практической конференции «Постгеномные методы анализа в биологии,лабораторной и клинической медицине» (Казань, 2012); the 38th FEBS Congress(Санкт-Петербург, 2013); Международном симпозиуме, посвященном 150-летиюобразования кафедры биохимии Казанского университета «Биохимия ‒ основа наук ожизни»(Казань,2013),IIIМеждународнойнаучнойинтернет-конференции«Медицина в XXI веке: тенденции и перспективы» (Казань, 2014).Публикации.
По теме диссертации опубликованы 90 работ, в том числе 13статей в российских журналах, рекомендованных ВАК РФ к публикации основныхрезультатов научного исследования, 1 патент, 2 статьи в коллективной монографии и8 учебных и учебно-методических пособий.8Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 262 страницахмашинописного текста и состоит из введения и четырех глав (обзор литературы,материалы и методы исследования, результаты собственных исследований и ихобсуждение),заключения,выводов,спискалитературы,включающего420источников (из них 299 – зарубежных), и приложения. Работа содержит 37 таблиц и50 рисунков.Работа выполнена в Институте фундаментальной медицины и биологииФГАОУ ВО «Казанский (Приволжский) федеральный университет».Работа поддержана грантами: ЦНИЛ КГМУ (2006‒2007); УниверситетаЕдитепе, Стамбул, Турция (2007‒2008); КФУ – Минобрнауки РФ, тема № бюджетФ11-02 (2011); КФУ – Минобрнауки РФ, тема № гос.
рег. 021000026, № бюджет 12-26(№ 13-64-ВП), НД02, ВД 0210 (2012–2013); РФФИ 12-03-97089-р_поволжье_а (2012–2014); НИР в рамках проектной части государственного задания в сфере научнойдеятельности по Заданию № 6.1139.2014/К (2014–2015); международным грантомPostdoctoralFellowshipИнститутаперспективныхисследованийМосковскогопедагогического государственного университета (2015).Личныйвкладдиссертантавполучениенаучныхрезультатов,изложенных в работе. В период с 2001 по 2015 гг. автором лично осуществлены:постановка цели и задач, планирование экспериментов, организация, координация ипроведение исследований.Тема диссертации соответствует приоритетному направлению модернизациии технологического развития РФ – «Науки о жизни» (Указ Президента РФ от 21 мая2006 г. № 843), а также перечню критических технологий РФ – «Геномные ипостгеномные технологии создания лекарственных средств» (Указ Президента РФ от7 июля 2011 г. № 899).МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯБиомаркеры жирнокислотного состава общих липидов грамположительнойBacillus subtilis и грамотрицательной Pseudomonas aurantiaca бактерий взависимости от температуры и фазы ростаШтамм OSU-142 Bacillus subtilis был взят из коллекции микроорганизмовкафедры генетики и биоинженерии Университета Едитепе, г.
Стамбул, Турция(Karlidag et al., 2007). Для каждой серии экспериментов одиночную колонию бактериипомещали в 500 мл колбу с питательным агаром и выращивали в колбе на качалке9(150 оборотов/мин) 48 ч при 28 оС. Штамм OSU-142 мог культивироваться напитательном агаре (Fluka), питательной среде (Sigma) или триптическом гидролизатесоевого агара (Fluka). В нашей работе логарифмическая (24 ч роста) и стационарнаяфазы (36 или 48 ч роста) культуры Bacillus subtilis, штамм OSU-142, были выращенына питательном агаре (Fluka) (Ибрагимова и др., 2012).Анализ жирнокислотного состава (метиловые эфиры жирных кислот, МЭЖК)общих липидов штамма Bacillus subtilis OSU-142 был выполнен методом газовойхроматографии с использованием системы MIDI (Sherlock Microbial IdentifticationSystem version 4.0, MIDI Inc., Newark, DE) в соответствии с описанными в нейпротоколами выращивания бактериальных культур и спецификацией приборов(Kunitsky et al., 2006).Штамм B-1558 Pseudomonas aurantiaca («Нахимовская 1948») был получен изколлекции микроорганизмов (Всероссийская коллекция микроорганизмов (ВКМ),ИБФМ РАН, г.
Пущино, Московская обл.) и предоставлен нам проф. Г.И. ЭльРегистан (Институт микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН, Москва)(Веремеенко, Максимова, 2010; Жданов и др., 2012; Peix et al., 2007). Использовалсяштамм ATCC 33663 = CIP 106718 = NCIMB 10068 = VKM B-876 (www.strainInfo.net).Этот штамм хранился и был выращен согласно протоколу, описанному выше дляBacillus subtilis OSU-142 (Ибрагимова и др., 2012; Peix et al., 2007).Выделение, идентификация и анализ липидов, прочносвязанных с ДНКДлявыделенияграмотрицательнойДНК-липидногокомплексаиспользовалиштаммбактерии Pseudomonas aurantiaca B-1558.
Природные ДНК-липидные комплексы выделяли с помощью фенольного и детергентного методов.Исследовали природу взаимодействия комплексов липидов и ДНК. Выделялифракции липидов, связанные с прокариотической ДНК, а именно слабо- ипрочносвязанныесДНКлипиды,иисследовалижирнокислотныйсоставпрочносвязанной фракции липидов методом газового хроматографа и массспектрометрии. Был разработан биохимический подход ‒ обработка препарата ДНК,выделенного из Pseudomonas aurantiaca, параллельно различными ферментами,гидролизующими или ДНК (ДНКаза I), или РНК (РНКаза А), или белки (протеиназа К)(Жданов и др., 2014).10Липидный и жирнокислотный составы фракций ДНК-связанных липидовPseudomonas aurantiaca по данным масс-спектрометрииДНК из штамма грамотрицательной бактерии Pseudomonas aurantiaca B-1558выделяли фенольным методом.
Выделяли слабо- и прочносвязанные фракции ДНКсвязанных липидов. Далее проводили жидкостную хроматографию и массспектроскопию пиков фракций ДНК-связанных липидов.Компьютерные эксперименты по исследованию взаимодействия ДНКс жирными кислотами методом молекулярной динамикиСтруктура лигандов и комплексов. Структурные параметры линолевой, олеиновойкислот и фосфатидилэтаноламина (ФЭ) с двумя остатками линолевой кислоты(нейтральная форма) были получены из базы данных HIC-Up (Kleywegt, 2007; Minkeet al., 1999), а структуры построены с помощью редактора молекул Avogadro.Структуры двухцепочечных олигонуклеотидов, состоящих из 20 A-T-пар (dA)20·(dT)20и 25 A-T-пар (dA)25·(dT)25, были сгенерированы с помощью утилиты NAB из пакетапрограмм AmberTools (AMBER 11, University of California, San Francisco, 2010).Координаты атомов комплексов даны в соответствии с общепринятой номенклатурой(Lin et al., 2002; McCammon, 2005; Morris et al., 1996; 1998; 2001).
Для полученияначальных структур комплексов жирная кислота была помещена в малую бороздкуДНК (в их кристаллографических конфигурациях) с помощью программы VMD.Комплекс был растворен в прямоугольной ячейке периодичности с использованиемTIP3P-модели молекул воды так, чтобы расстояние между периодическими образамикомплекса составляло не менее 15 Ǻ. Для обеспечения электронейтральности системыбыло добавлено необходимое количество ионов натрия. Для полученной структурыбыла выполнена минимизация энергии с помощью метода сопряженных градиентов впрограммеNAMD(Phillips,2005).ПригенерированииструктурыДНКиспользовалась программа AMBER99 (Wang et al., 2004), а для характеризациилигандов ‒ программа GAFF (General Amber Force Field) c зарядами AM1-BCC(Жданов и др., 2014; Тарасов и др., 2012).Молекулярная динамика.
Траектория молекулярной динамики рассчитывалась спомощью программного пакета NAMD. Длины связей были фиксированы с помощьюалгоритма SHAKE, что позволило использовать шаг расчета траектории, равный 2 фс.Все траектории рассчитывались для температуры 300 К.
Перед расчетом свободнойэнергии связывания и сбором параметров система была приведена к равновесию втечение 200 пс. Полученные траектории анализировались с помощью программного11пакета VMD, а также с помощью дополнительных скриптов, написанных на языкеPython. При анализе нековалентных контактов между атомами жирных кислот иолигонуклеотида рассматривались атомы, расстояние между которыми не превышало3,4 Ǻ (3,4 Ǻ соответствует максимуму ван-дер-ваальсова притяжения между атомамиуглерода) (Жданов и др., 2014; Тарасов и др., 2012).Свободная энергия связывания. Определение свободной энергии связыванияпроводилосьметодомадаптивнойсмещающейсилы(Darveetal., 2008),реализованным в программе NAMD (Henin et al., 2010).Влияние мутагена на содержание индикаторов перекисного окисления липидов,биоэлементов и состояние системы антиоксидантной защиты организмаЭксперименты проведены на 48 белых рандобредных лабораторных крысахобоих полов SPF категории, в каждой группе по 4 самки и 4 самца массой 230‒250 г.Животные содержались в условиях вивария согласно международным критериям наподстилку rinofix, корм и воду ad libitum.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
