Диссертация (Функциональное состояние клеток при действии ультразвуковых волн (биохимические и физиологические аспекты)), страница 13

Количество связанногоконъюгата определяли проведением ферментной реакции со специфическим субстратомпероксидазы.ФерментативнуюактивностьопределялиметодамиН. М. Титовой,Т. Н. Замайи Г. И. Боровиковой [22]. Активность измеряли в стандартных условиях по увеличению скоростикаталитической реакции по сравнению с некаталитической. Скоростью реакции считаетсяизменение концентрации субстрата или продуктов за единицу времени (ммоль/л в секунду).48Международная единица (Ед, МЕ) это количество фермента, превращающего 1 мкмоль субстратав 1 минуту [94].Для определения биохимических показателей сыворотки и плазмы крови животных:активности креатинкиназы (КК), щелочной фосфатазы (ЩФ), аланинаминотрансферазы (АлАТ),аспартатаминотрансферазы (AсАT), лактатдегидрогеназы (ЛДГ) — использовали отечественныетест-системы «Эколаб» и автоматический биохимический анализатор URIT — 8030.

В среднемпроводили не менее 7–10 измерений на точку. Данные средних значений биохимическихпоказателей крови даны по Р. Кирку [94]. В работе использованы реактивы фирмы «Sigma»,«Merk», реактивы отечественного производства (ч.д.а).Определение активности лактатдегидрогеназыМетод определения ЛДГ основан на различии спектров поглощения окислённойи восстановленной форм НАД при 340 нм.

Активность ЛДГ в сыворотке крови лошади,определённая этим методом, в норме при 25–30°C находится в диапазоне 125–381 МЕ, чтосоответствует2051–6250нмоль/(с × л)[113].АктивностьЛДГопределялиспектрофотометрически и с использованием автоматического биохимического анализатораURIT–8030. Референтные интервалы: для собак — 23–164 МЕ, для кошек — 55–155 МЕ, длялошадей — 100–400 МЕ [94].

У молодых, растущих животных активность ЛДГ увеличена в 2–3раза.Определение активности аминотрансферазСуществует 2 группы методов определения активности трансаминаз в сыворотке крови:спектрофотометрические и колориметрические. В основе спектрофотометрических методовлежит использование оптического теста Варбурга, эти методы наиболее специфичные и точные.Колориметрическиеметодыоснованынаобразованиикрасно-буроокрашенногодинитрофенилгидразона пировиноградной кислоты, освобождающейся в результате реакциипереаминирования.Наибольшеезначениеаспартатаминотрансферазыимеет(АсАТ,АСТ,определениеангл.активностиSGOT —Serumдвухферментов:GlutamicOxaloaceticTransaminase) и аланинаминотрансферазы (АлАТ, АЛТ, англ.

SGPT — Serum Glutamic PyruvicTransaminase), поскольку эти ферменты обладают большой каталитической активностью.В качестве единицы принята активность трансаминазы, содержащейся в 1 мл сыворотки(плазмы) крови, которая в условиях описанного метода образует 1 мкг пировинограднойкислоты.49Основа метода: гидразон пировиноградной кислоты в щелочной среде даёт коричневокрасное окрашивание, интенсивность которого пропорциональна количеству образовавшейсяпировиноградной кислоты, а по количеству образовавшейся пировиноградной кислоты можносудить об активности фермента.Активность аминотрансфераз выражают в микромолях пировиноградной кислоты,образовавшейся в 1 мл сыворотки крови за 1 ч инкубации при 37ºС, или в международныхединицах (МЕ/л).Активность АсАТ в норме составляет: для собак — 11–42 МЕ, для кошек — 9–29 МЕ, длялошадей — 130–300 МЕ; АлАТ: у собак — 9–52 МЕ, у кошек — 19–79 МЕ, у лошадей — 2.7–20 МЕ.Определение общей активности креатинкиназы в сыворотке и плазмекрови кинетическим методомКинетическое спектрофотометрическое определение активности КК основано нарегистрации возрастания оптической плотности анализируемой пробы при длине волны 340 нм.Скорость увеличения оптической плотности пробы при длине волны 340 нм прямопропорциональна активности КК в ней.

Линейность метода: до 1500 МЕ/л. Референтныеинтервалы: для собак — 32–157 МЕ, для кошек — 150–798 МЕ, для лошадей — 50–300 МЕ [94].Определение активности щелочной фосфатазыОпределение основано на регистрации изменения оптической плотности образца придлине волны 405 нм в результате протекания реакции:ДЭА, Мg 2+п-нитрофенилфосфат + Н2О = п-нитрофенол + фосфатЩФ, pH 10Скоростьобразованияв результатереакцииокрашенногоп-нитрофенолапропорциональна активности щелочной фосфатазы (ЩФ).К сыворотке крови в количестве 15 мкл добавляли 1 мл раствора буфера (содержащий1 мМ диэтаноламина (ДЭА) и 0.5 мМ соли магния)) и термостатировали в течении 10 мин.

при37°C. Затем добавляли 200 мкл 10 мМ п-нитрофенилфосфата (инициатор реакции) и в течение3 мин через каждую минуту измеряли оптическую плотность каждого образца. По соотношениюсреднего значения оптической плотности облучённой опытной пробы к оптической плотностиконтрольной пробы определяли изменение активности каждого образца.Расчёт активности фермента проводили по следующей формуле: А = Ео / Eк × 100%50где Еo — изменение оптической плотности за время воздействияЕк — изменение оптической плотности контрольной пробы.Активность образца определяли спектрофотометрически на длине волны 405 нм (SpecordM–40, «Karl Zeiss», Yena). Измерение проводили по схеме контроль — опыт для каждой частотымодуляции (5 измерений на точку). Норма для собак — 18–70 МЕ, для кошек — 39–55 МЕ, длялошадей — 70–250 МЕ.

У молодых животных активность ЩФ также увеличивается в несколькораз.Методы идентификации и степени очистки выделенного интерферона:электрофорез, метод Старки, определение полиэтиленгликоля в пробеИдентификация ИФН проведена методом электрофореза с додецил-сульфатом натрияв полиакриламидном геле. После очистки ИФН был сконцентрирован от 10 мл до 0.5–1 млметодом ультрафильтрации при 6°C на аппарате “Amicon cell equipped”, мембрана PM 10. pHобразца доводили до 6.8 буфером 0.05 м Трис — НС1, добавляли 10% (объёма) глицерин и 1%додецилсульфат натрия (1:1). Затем вносили 0.002% бромфенолсинего и инкубировали 2 час при25°C перед электрофорезом.В процессе получения ИФН степень протеолиза определяли методом Старки [375] приконтроле активности специфических лейкоцитарных протеиназ и их ингибитора α2 —макроглобулина (α2M).В качестве субстрата применяли азоказеин.

Белок-субстрат содержит жёлтоокрашенныеазогруппы. Пептиды «вычленяются» из белков активной эндопептидазой, которая можетприсутствовать в растворе, содержащем неочищенный ИФН. Реакция останавливается последобавления трихлоруксусной кислоты. Интенсивность окраски раствора прямо пропорциональнаактивностипротеиназ.Оптическаяплотностьжёлтогораствораанализировалинаспектрофотометре СФ-46 λ=366 нм против контроля (рабочая длина кюветы 10 мм).Полиэтиленгликоль применяли как осадитель глобулинов сыворотки крови. Егодобавляли на стадии биосинтеза в среду, а затем по окончании этого процесса в ходе очисткиИФН удаляли.

Для этого ставили контроль на присутствие полиэтиленгликоля. Метод основанна реакции комплексообразования оксиэтильных групп полиэтиленгликоля с трихлоруксуснойкислотой. Образовавшийся комплекс анализировали фотоэлектроколориметрически илиспектрофотометрически после удаления белка из раствора.51§ 5.4. Физические методыКак было указано выше, для проведения исследований использовали отечественныеаппараты: УЗТ–1.01Ф; Ультразвук Т–5, УЗТ–1.02С и УЗТ–3.03; УЗТ–3.06, работающие на двухчастотах (0.88 и 2.64 кГц) в непрерывном и импульсном режимах. В импульсном режиме подачаУЗ излучения прерывается паузой, за счёт чего уменьшается доля теплового компонента.МетрологияПроведена метрология с целью определения распределения УЗ поля в среде приинтенсивностях 0.4; 0.7; 1.0 Вт/см2. В зависимости от расположения дифференциальнойтермопары относительно излучателя выполнена её калибровка по интенсивности УЗ.Для регистрации УЗ была использована дифференциальная термопара, один из спаевкоторой покрыт поглощающим УЗ полимером (рисунок 2).

Показания разности поглощения УЗв спаях фиксировались на микровольтметре. Кювету, к которой присоединяли излучатель отУЗТ-3.06, заполняли водой. Отражённый (от 1 и 2) УЗ поглощался (3). Расположение термопарынастраивали по вертикальной и горизонтальной осям. Так как пик поглощения приходился нацентр излучателя, изначально термопару располагали на этом уровне. Далее, перемещаятермопару вдоль вертикальной оси, искали точку максимального показания амперметра. Точкойначала отсчёта являлось расположение термопары по краю излучателя.

При включённомизлучателе смещали термопару на одни и те же небольшие расстояния (0.5 мм) и снималипоказания прибора в этих точках при УЗ интенсивностях 0.4, 0.7, и 1.0 Вт/см2. По результатамизмерения строили калибровочный график.3.ПоглощающийУЗматериал из тефлона4. Излучатель1 и 2. Отражающая УЗ поверхностьРисунок 2.

КюветаНа построенном графике (рисунок 3) определяли площадь под кривой. Если разделитьплощадь под кривой на диаметр излучателя, то получится величина средней по пространствуи времени интенсивности. Интенсивности, равные 0.4; 0.7 и 1.0 Вт/см2, соответствоваливеличине напряжения, полученной с помощью термопары.52а)б)Рисунок 3. Калибровочные графики дифференциальной термопары для интенсивностей 0.4 (а) и 1.0 (б) Вт/см2.Метод визуализации звуковых волнДля распределения УЗ поля в среде при разных интенсивностях (0.4; 0.7; 1 Вт/см2) былииспользованы: ёмкость, заполненная водой и красителем метиленовым синим, приборы УЗТ–1.01Ф и УЗТ–3.06. Фиксированную бумагу помещали в раствор на разных расстояниях отизлучателя (со сдвигом вниз по вертикали на 1 см) и включали прибор, используя различныеинтенсивности.

Время действия УЗ было постоянным и равнялось 1 мин. Полученныераспределения на бумаге сканировали (рисунки 4 и 5).(7 см.)(8 см.)(9 см.)(10 см.)Рисунок 4. Результаты распределения в среде поля излучателя УЗТ–1.01Ф; интенсивность УЗ 1.0 Вт/см2 (в скобкахуказано расстояние до излучателя).53Рисунок 5. Распределение поля в среде излучателя УЗТ–1.01Ф. Интенсивность УЗ 0.4 Вт/см2, диаметр излучателя12.44 мм; расстояние до излучателя 0.5 см.Картина распределений интенсивностей УЗ в объёме сделана на основе методавизуализации ультразвукового поля Т.