Диссертация (Функциональное состояние клеток при действии ультразвуковых волн (биохимические и физиологические аспекты)), страница 10

При этом плотность звуковой энергии, плотностьклеток и температура являлись факторами, определяющими эффективность трансфекции клетокрака простаты человека (DU145) в акустическом поле.При изучении влияния амплитудно-модулированного УЗ на активность ферментов кровикролика, крысы и человека (несущая частота 0.88 МГц) впервые было установленоразнонаправленное воздействие УЗ терапевтического диапазона интенсивностей. Активностькреатинкиназы (КК) увеличивалась после инсонации интенсивностью 1.0 Вт/см2 на частотах34модуляции 2–3 Гц и 7–8 Гц и понижалась вблизи частот модуляции 4 и 10 Гц.

Воздействие нащелочную фосфатазу (ЩФ) также могло менять активность фермента в разном направлении,увеличивая в диапазоне частот модуляции 350–370 Гц и на интенсивностях от 0.7 до 1.0 Вт/см2.Тот же диапазон частот модуляции, но при интенсивности 0.2 Вт/см2 уменьшал активностьданного фермента. Активность третьего фермента, лактатдегидрогеназы, уменьшаласьв частотном диапазоне модуляции 300–400 Гц после обработки интенсивностью УЗ 0.2 Вт/см2,увеличивалась — при интенсивности УЗ 0.7 Вт/см2 [152].В обзоре Л. Джонса [301] описано влияние УЗ на активность ряда ферментов. Имсформулирована частотно-резонансная гипотеза, описывающая два возможных биологическихмеханизма, которые могут изменить функцию белка в результате поглощения УЗ энергии.

Вопервых,поглощениемеханическойэнергиибелкомможетвызыватьпереходныеконформационные сдвиги (изменяющее 3-мерную структуру), вследствие чего изменяетсяфункциональная активность белка. Во-вторых, резонансные или сдвиговые свойства волны (илиони оба) могут приводить к диссоциации многомолекулярного комплекса, тем самым нарушаяфункцию данного комплекса.Концепция поглощения УЗ энергии энзимами, приводящего к изменению активностиферментов, не нова [242]. Существует вероятность того, что, в отличие от тромболизиса,активность КК, ЛДГ, гексокиназы и пируваткиназы не зависит от частоты терапевтического УЗ[242, 304]. Однако, как мы указали раньше, не сформулирована однозначная гипотезавозможности направленного управления состоянием активности ферментов сыворотки и плазмыкрови с помощью непрерывного, а также амплитудно-модулированного УЗ терапевтическогодиапазона интенсивностей.

Возможно, подавление активности ряда ферментов вызванообразованием свободных радикалов в инсонированной среде [9].Таким образом, в представленной литературе практически для всех уровней организацииорганизма показана возможность существования энергетических, частотных и амплитудных«окон» при характеристике биоэффектов электрических и магнитных полей, что позволяетдопустить нетепловой механизм биологического действия. Направление эффекта определяетсяне только временем воздействия и интенсивностью излучения, но и различными режимамимодуляции.Изучены и определены основные механизмы действия на биологическую тканьнепрерывного ультразвука. Тем не менее, нет данных по влиянию амплитудно-модулированногоУЗ терапевтического диапазона интенсивностей на кровь как единственную подвижную тканьживотных, обладающую системой гомеостаза, и не определены опасные и безопасные частотныедиапазоны для клеток и ферментов крови.35ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬII.

МЕТОДОЛОГИЯ И МАТЕРИАЛЫ ИССЛЕДОВАНИЯМетодология проведённых исследований базировалась на теоретических, численныхи эмпирических подходах. При проведении работы использовались общенаучные и специальныеметоды, традиционные для области ветеринарной биохимии, физиологии, биофизики,паразитологии, гематологии, микробиологии и цитохимии. Этапы постановки эксперимента3.

Объекты работы§ 3.1. Культуры бактерий и архейВ качествемикроорганизмов —тест-объектовбылибактерийи архей —выбраныпредставителикультураморскойодноклеточныхлюминесцирующейгалотолерантной бактерии Aliivibrio fischeri 6 и культура экстремально галофильной археиHalobacterium halobium ET 1001 из коллекции культур микроорганизмов МГУ.

В своей работемы изучали стабильность роста указанных таксономически отдалённых культур эубактерийи архей, различающихся клеточными покровами и другими значимыми физиологическимии биохимическими признаками.В состав ростовой среды для культивирования бактерий входили (в г/л): пептон — 10,дрожжевой экстракт — 1, NaCl — 30, Na2HPO4 — 5.3; КН2РO4 —2.1; (NH4)2SO4 — 0.5, MgSO4 —0.l; глицерин — 3 мл; pH среды 7.4.

В качестве посевной служила культура, выращенная на тойже среде до стационарной фазы роста с исходным количеством клеток после посева 2–3 × 106 на1 мл. Для культивирования использовали колбы ёмкостью 250 мл с 50 мл среды, которыепомещали на качалку со скоростью перемешивания 90 об/мин при 20°C. Поддерживающаясреда — питательный агар с пептоном, глицерином, дрожжевым экстрактом, 1.7% NaCl, pH 7.2–7.4.В момент максимального свечения клетки культуры A. fischeri (контрольный и опытныйобразцы) отбирали, опытный — подвергали воздействию фактора, и оба образца использовалидля засева питательной среды в качестве инокулюма.

Последнее предпринимали с цельюпоследующего анализа закономерностей УЗ воздействия, основываясь на показателе роста,сохранении жизнеспособности бактерии и эмиссионных характеристик. Оптическую плотностьсуспензии клеток определяли на колориметре КФК-2МП при 590 нм. Биолюминесценцию клетокизмеряли в 4-см кварцевых кюветах при комнатной температуре и времени экспозиции 10 мин(температураисследуемойинкубационнойсмесиклеток22°C)налабораторномбиолюминометре, состоящем из фотоумножителя ФЭУ–85 и микровольтметра В2–15.36В качестве посевного материала использовали клетки культуры, выращенные достационарной фазы роста в оптимальных условиях.

Исходное количество клеток после посева 2–3 × 106 в 1 мл. Среда для выращивания экстремально галофильных архей включала (в г/л):дрожжевой экстракт (Difco) — 10, казаминовые кислоты (Difco) — 7.5; цитрат натрия — 3,KCl — 2, NaCl — 250, MgSO4 ∙ 7H2O — 20, FeCl2 ∙ 4H2O — 3.6 мг, MnCl2∙4H2O — 0.36 мг; pH 7.4.Археи выращивали в колбах Эрленмейера объёмом 500 мл со 100 мл среды 5 суток при 37°С накачалке при 180 об/мин и освещении монохромным светом с длиной волны λ = 560 нм.Поддерживали культуру на твёрдой пептоновой среде (2% агар) с 4.3 м NaCl.Об интенсивности роста H.

halobium судили по оптической плотности суспензии,измеренной при длине волны λ = 620 нм на спектрофотометре СФ — 46 (Россия).§ 3.2. Выделение лейкоцитов и получение интерферонаДля получения ɑ-интерферона, а также для изучения стимулирующего и ингибирующегодействия УЗ in vitro использовали лейкоциты. Их выделяли только из свежеполученнойдонорской крови [110]. При отделении эритроцитов от лейкоцитов использовали два метода:фракционированиес коллоиднымиосадителямии гемолиз.Дляфракционированияиспользовали грушевидные колбы-отстойники с верхними и нижними отводами. В колбызаливали стабилизирующий раствор, состоящий из апирогенной дистиллированной воды,глюкозы, аскорбиновой кислоты, CaCl2 и цитрата натрия.

В раствор вводили лейкоцитарнуюмассу, прибавляли осадитель: декстран с молекулярной массой 100 кД и поливиниловыйспирт, — затем суспензию в колбе тщательно перемешивали и выдерживали 40 мин при 4°С. Поддействием коллоидных осадителей происходила агрегация эритроцитов, что ускоряло ихвыпадение из суспензии. Тёмноокрашенная нижняя фракция содержала основную массуэритроцитов, светлоокрашенная состояла из лейкоцитов. Клетки отделяли, центрифугировалипри 1250 об/мин (600 g) в течение 15 мин при температуре 4°C и суспензировали в среде 199с 0.5% этилендиаминтетрауксусной кислоты. Остаточные эритроциты удаляли методомгемолиза [там же].Жидкую часть лейкомассы фракционировали, после чего проводили прайминг (обработкулейкоцитов гомологичным интерфероном) и индуцировали биосинтез ИФН вирусом болезниНьюкасла. Получение вируса-индуктора и индикаторного вируса осуществляли общепринятымметодом [там же].

Хранили лейкоцитарную массу в течение одних суток при температуре 4°С.Число живых клеток в свежеприготовленной суспензии клеток лейкоцитов как до, так и послевоздействия УЗ, определяли при помощи теста с трипановым синим. Для исследованийиспользовали суспензию лейкоцитов, в которой исходное количество живых клеток составлялоне менее 80% от их общего количества. Все этапы суспензионного биосинтеза лейкинферона37проводили по методу авторов, защищённому Авторским свидетельством [2; рисунок 115 вПриложении Б1 на странице 321]. В качестве токсико-чувствительного тест-объекта дляопределения чистоты ИФН, синтезированного лейкоцитами после действия УЗ, использовалиморские люминесцирующие бактерии.§ 3.3.

Отделение эритроцитовРазделение клеток крови и их концентрирование проводили на аппарате УЗТ-3.06,работающим на частоте 2.64 МГц, с интенсивностью в фокальной зоне излучателя, достигающей17 Вт/см2, с использованием УЗ ингалятора ИнгПорт. Верхняя часть прибора представляла собойшаровидный сосуд.

Перед работой для очистки УЗ ингалятора через ёмкость пропускалидистиллированную воду, затем заполняли физраствором и при включённом УЗ пропускалиразбавленную физраствором кровь с гепарином. Далее включали нанос, создающий сильный токжидкости, проходящий через сосуд. Использовали различное время работы насоса (1, 2 и 3 мин).Для подсчёта клеток в полученной суспензии использовали камеру Горяева (см.

п. 5.1.3. Подсчёттромбоцитов и эритроцитов на странице 45). На фотографии (рисунок 1) показан препаратполученных эритроцитов (время протекания крови 2 мин).Рисунок 1. Препарат эритроцитов§ 3.4. Использование биосенсоровПри анализе физиологического отклика микроорганизмов на внесения белков, пероксидаводорода, изменение pH, длительности инкубации, температурного режима, и воздействиеультразвуком использовали количественную оценку тест-реакции, которую выражали в видевеличины индекса токсичности.

Она была равна отношению (I/I0) •100%, где I0 и I интенсивностьбиолюминесценции контроля и опыта при фиксированном времени экспозиции и температуре(30 мин,22°C)исследуемойинкубационнойсмесис клеткамибактерии.В качестве38сравнительного контроля качества оценки определяли чувствительность бактерий на модельныйтоксикант — ZnSO4 ∙ 7H2O (1 мг/л), при действии которого в течение 30 мин гашение свечениясоставляет 50% (LD50).При использовании светящихся бактерий в качестве тест-системы для оценки воздействияУЗ и указанных физических и химических факторов анализировали излучение света и реакции,сопряжённые с ростом культуры.Для установления оптимальной температуры роста культуру A.

fischeri до достижениямаксимальной биомассы и интенсивности свечения, пересевали на свежую среду (контроль —параллельно) и инкубировали в области температур 10–40°C. Для определения зависимостилюминесценции бактерий от величины pH использовали 0.1 М натрийфосфатно-карбонатныйбуфер с 3% NaCl и pH в диапазоне 5.0–9.0.При изучении воздействия на свечение пероксида водорода клетки инкубировалис различными концентрациями H2O2 — от 0.00003 до 0.01% — и оценивали влияние фактора.Воздействие белков на интенсивность люминесценции изучали, внося лейкинферон илисывороточный альбумин в концентрации от 20 до 35%, инкубируя разное время. Для экспрессконтроля на отсутствие токсичности синтезированного α–ИФН полученный препарат вносилив различныхразведенияхв бактериальнуюсуспензиюA.