Диссертация (Функциональное состояние клеток при действии ультразвуковых волн (биохимические и физиологические аспекты)), страница 11

fischeriс последующимкультивированием по ранее указанной методике (§ 3.1. Культуры бактерий и архей настранице 35). Активность интерферона варьировала в пределах 125–2500 МЕ/50 мл суспензии.Исследовали показатели оптической плотности и интенсивности свечения сразу после внесенияпрепарата, а также в динамике роста. Параллельно при работе с непрерывным УЗ проводилиэксперименты с цитостатиками — доксорубицином (0.8 мг/мл), циклофосфаном (0.2 мг/мл)и этилендиаминтетрауксусной кислотой (от 10-3 до 1 мг/мл).§ 3.5.

Домашние и лабораторные животныеГруппы животныхВ ряде экспериментов in vivo были использованы лабораторные животные: кроликии мыши. Экспериментальные группы формировали из животных без видимых физиологическихотклонений. В группы входили 20 беспородных половозрелых самцов мыши весом по 24–26 г10–12 недельного возраста и 3 кролика породы белый великан возраста 1.5–2 года. 10 мышейоставались интактными, составив группу контроля, для которых УЗ не применяли. У кроликовответную реакцию организма на УЗ воздействие in vivo наблюдали в течение последующих 7–10дней.39Контроль состояния животных проводили ежедневно.

Проведение экспериментальныхработ(включаясодержание,кормлениеиуход)соответствовало«Международнымрекомендациям по проведению медико-биологических исследований с использованиемживотных». Рационные корма соответствовали ГОСТ Р 5025892.Подбор животных в группы осуществляли с учётом аналогов фоновых физиологических,биохимических и гематологических показателей, а также состояния здоровья, пола, возраста,лейкограмм, ферментного профиля сыворотки и плазмы крови и прочее).Собаки.1) При исследовании особенностей и закономерностей влияния УЗ на клетки кровимолодых и животных старшего возраста собак разделили на две возрастные группы по 10 особейв каждой. Группа 1 — возраст от 2 до 6 лет; группа 2 — животные старше 14 лет.

Контролемслужила кровь тех же 20 собак без УЗ воздействия. Группы формировали из животныхс аналогичными фоновыми показателями. Все животные были клинически здоровы, что былоподтверждено диагностическими обследованиями и клинико-гематологическими анализами.2) Животные с паразитемией, инвазированные, при моноинвазиях и смешанной инвазии.В исследовании использовали кровь 6–8-летних взрослых собак разного пола и разных пород.Животных разделили на три группы: собаки с диагностированным бабезиозом (n=10), больныедирофиляриозом (кожная форма) собаки (n=10) и животные со смешанной инвазией (бабезиоз +дирофиляриоз) (n=3).

Контролем служила кровь тех же 23 собак после окончательноговыздоровления.3) Опыты по установлению минимального порога биологического действия УЗ былипоставлены на образцах крови взрослых здоровых собак обоего пола из 4 групп. Группы и в этомслучае формировали из животных с близкими фоновыми показателями, от 18 до 24 особейв группе. Группа №1: возраст от 1 года до 3 лет, №2–4–6 лет, №3–7 и 8 лет, в группу №4 входилиживотные от 9 до 11 лет.При определении возможных видовых особенностей поведения клеток крови в поленепрерывной и амплитудно-модулированной УЗ волны в работе также были использованыобразцы крови, оставшиеся от клинических и биохимических плановых обследований собачьихв ветеринарных клиниках или зоопарке от волков, лис, и собак разных пород, веса, возрастаи пола (n=42).Кошки. Формирование групп в зависимости от возраста и состояния здоровья.

Группа 1 —возраст животных до 3 лет (10 особей); группа 2 — от 3 до 7 лет (8 особей); группа 3 — от 8 до13 (7 особей); группа 4 — животные старше 14 лет (9 особей). Все животные были клиническиздоровы. Экспериментальные группы здоровых животных формировали из особей безфизиологических отклонений, с близкими фоновыми показателями.40С целью определения восприимчивости и резистентности клеток крови здоровыхи больных животных к УЗ воздействию, а также возможных изменений жизнеспособностиклеток крови в эксперименте была задействована группа котов и кошек с болезнями обмена наразных стадиях заболеваний. Возраст кошек со скрытыми и латентными заболеваниями — от 1года до 14 лет.Малый объём крови, требуемый для каждой серии опытов по определению видовыхособенностей поведения клеток крови в УЗ поле, позволял без ущерба для здоровья животногозабирать в эксперимент образцы крови, оставшиеся от клинических и биохимических плановыхобследований кошачьих в ветеринарных клиниках, зоопарке или цирке диких (тигр — две особи,лев — три особи) и домашних кошек разных пород, веса, возраста и пола (40 особей).Лошади.2 возрастные группы по 9 особей в каждой.

Группа 1 — возраст от 6 до 12 лет; группа 2 —животные от 15 до 21 года. Контролем служила кровь тех же 18 животных без УЗ воздействия.Группы формировали из лошадей с близкими фоновыми показателями. Все животные быликлинически здоровы, что было подтверждено диагностическими обследованиями и клиникогематологическими анализами.С целью изучения изменений клеток крови здоровых и больных животных в результатевоздействия УЗ была сформирована группа из коней и лошадей с хроническими заболеваниямиобмена, сердечно-сосудистой, опорно-двигательной и дыхательной систем на разных стадиях.Возраст животных — от 3 до 12 лет (n=8).Биологический материалКровь, сыворотка и плазма кровиПри работе in vitro забор крови у всех животных проводили натощак в утренние часы вовремя диагностического обследования, диспансеризации и ежегодного контроля здоровьяв количестве 1–2.5 мл для клинического исследования и облучения УЗ, а при необходимости —дополнительно 2–4 мл для биохимического исследования, что не превышало 1% от объёмациркулирующей крови.

Транспортировку образцов осуществляли без доступа воздуха притемпературе 0–4°C для стабилизации процессов свободнорадикального окисления.Кровь брали из периферических вен: у кошек и собак из вены сафена или подкожной веныпредплечья, у лошадей из яремной вены, у кролика из краевой вены уха. Ни одно животное непострадало. В связи с необходимостью получения большого количества повторов опытав различных параллелях на одном и том же образце (требования, предъявляемые математическойстатистикой) при разработке методики инсонации вначале облучению подвергали образцы крови41лошадей.

От мелких лабораторных животных такой объём крови можно получить толькодекапитацией нескольких животных, что делало невозможным отработку вариативной части.Сыворотку и плазму крови получали общепринятыми методами [104].СеменникиЧерез 46 ч после инсонации in vivo беспородных половозрелых самцов мыши выводилииз эксперимента с помощью эфирной эвтаназии, извлекали семенники, фиксировали их в смесиформалина, спирта и уксуса, затем помещали в парафин, готовили пятимикронные срезыи окрашивали галлоцианином. На каждую точку брали по 5 животных. У каждого семенникапросчитывали не менее 50 канальцев. Вертикальное и боковое движение среза делалось всегдав одном направлении, так, чтобы не просчитывать дважды один и тот же каналец. Подсчётклеточных элементов семенного канальца производили на 7 стадии клеточного цикла.

Стадииопределяли по сочетанию клеток, заполнявших семенные канальцы. Седьмая стадия былавыбрана потому, что на этой стадии представлены клетки семенного эпителия разной степенисозревания: первичные покоящиеся сперматоциты, пахитенные сперматоциты, сперматидыи зрелые сперматозоиды.424. Способы ультразвукового воздействия на объектыисследованияДляпроведенияультразвуковоговоздействияиспользовалиотечественныеультразвуковые терапевтические аппараты с излучателями, работающими на несущей частоте0.88 МГц: УЗТ–1.01Ф; Ультразвук Т–5, УЗТ–1.02С и УЗТ–3.03; УЗТ–3.06, работающие начастоте 2.64 МГц, модифицированные для работы с внешней модуляцией. Модулирующиегенераторы Г3–112 и ГЗ–110 обеспечивали возможность создания сигнала для модуляциив широком диапазоне частот (0.001 Гц — 1999 кГц). Нами был использован предельный случайамплитудной модуляции — импульсная модуляция со скважностью 2.

Это позволяло проводитьравноэнергетическое воздействие на клетки, выявляя биологически активные частоты безсопутствующегоразогреваклеток.ИнтенсивностьУЗконтролировалис помощьюдифференциальной термопары, калиброванной по интенсивности.§ 4.1. Методика обработки суспензий клетокНаклеткиA.

fischeriи H. halobiumвоздействовалив течение3–15 минУЗинтенсивностью 0.2 и 0.4 Вт/см2 в диапазоне частот модуляции от 0.1 до 10 Гц, а также 10.0–1000 Гц с помощью аппарата Ультразвук Т–5 в кювете специальной конструкции, практическиобеспечивающей отсутствие стоячих волн [3; рисунок 116 в Приложении Б1 на странице 321]Объём облучаемой суспензии 10 мл. Для поддержания постоянной температуры суспензии приоблучении её ультразвуком использовали ультратермостат УТ–15. Опытные и контрольные«неозвученные» клетки по окончании экспозиции использовали для засева питательной средыи изучали ответный отклик: интенсивность люминесценции и рост культуры.

Интенсивность,стимулурующая ростовые и эмиссионные процессы люминесцирующих бактерий, а такжедлительность облучения были выбраны на основе ранее полученных нами экспериментальныхданных [138, 139, 237, 238]. Частота генерации 0.88 МГц, синусоидальная модуляция с глубиноймодуляции 100%. Получение модулированного сигнала осуществлялось изменением напряженияна сетке лампы ГУ 50 с нужной частотой модуляции.Для инсонации клетки бактерий A.

fischeri отбирали в момент максимального свечения; изкаждой пробы суспензии пробы было сделано не менее 12 повторов.Для стимуляции интерфероногенеза, а именно выхода лейкинферона с помощьюобработки суспензии лейкоцитов УЗ, использовали разработанную нами схему воздействиянепрерывным УЗ на суспензию «отработанных» лейкоцитов, защищённую Авторскимсвидетельством СССР [2; рисунок 115 в Приложении Б1 на странице 321]. Температурав суспензии при облучении УЗ поддерживалась 20°C. Распределение интенсивности вдольдиаметра кюветы определяли с помощью термопарного зонда и методом визуализации УЗ поля,43основанным на ускорении УЗ диффузии водорастворимых красителей в пористые среды.

Частотагенерации 0.88 МГц, частоты модуляции из диапазона 700–900 Гц, интенсивность 0.05 Вт/см2,время экспозиции 30 с — 1 мин (найдены экспериментально). Объём обрабатываемой суспензии10 мл содержал 6 × 106 кл/см3. Опытные («облучённые» в пяти–семи повторах) и контрольныеобразцы помещали в колбы со средой для биосинтеза.Эритроциты. УЗ обработке подвергали образцы суспензии объёмом по 1.0–1.5 мл,содержащей 6 × 109 кл/см3. Время воздействия от 3 до 120 с, значение усреднённой попространству интенсивности излучения УЗ — от 0.05 до 2.0 Вт/см2.