Диссертация (Функциональное состояние клеток при действии ультразвуковых волн (биохимические и физиологические аспекты)), страница 12

Частотный диапазонмодуляции10–1000 Гц.Дляоблученияиспользовалиотечественныеультразвуковыетерапевтические аппараты с излучателями, работающими на несущей частоте 0.88 МГц: УЗТ–1.01Ф и УЗТ–1.02С, модифицированные для работы с внешней модуляцией. Термостатированиеобъёма камеры с образцами клеток проводили с помощью термостата U7C.§ 4.2. Методика обработки цельной крови и сывороткиМетод УЗ обработки клеток крови был разработан нами, защищён двумя авторскимисвидетельствами, прошёл верификацию в Институте медико-биологических проблем РАНв научной лаборатории д.б.н.

А. М. Носовского. Подробно изложен в совместных публикацияхв журналах ВАК «Биомедицинская радиоэлектроника», 2014.Воздействовали ультразвуком in vitro на жидкую подвижную ткань — кровь, в которойодновременно представлены клетки разного вида, размера и возраста.

Среднее количестволейкоцитов в суспензии при обработке УЗ составляло (6–7) × 106 кл/см3, среднее количествоэритроцитов — (6–7) × 109 кл/см3. Для обеспечения постоянной концентрации образцыразбавлялись сывороткой крови того же животного. Для проведения УЗ воздействияиспользовали аппараты с излучателями, работающими на несущей частоте 0.88 МГц: УЗТ–1.01Ф; Ультразвук Т–5, УЗТ–1.02С и УЗТ–3.03; УЗТ–3.06, работающие на частоте 2.64 МГц.Камеры для воздействия УЗ на клетки термостатировались с помощью термостата U7C.Продолжительность воздействия от 5 с до 5 мин, шаг 5 с. ISATA — средняя по пространствуи времени интенсивность — от 0.05 Вт/см2 до 2.0 Вт/см2. Режим непрерывный, импульсныйв режиме 10 мс со скважностью 2 и амплитудная модуляция.Частотный диапазон модуляции 10–1000 Гц. Объём опытных образцов составлял 1–1.5 мл.

Пробы крови инсонировали в абсолютно одинаковых условиях (площадь излучателя,охлаждение, циркуляция жидкости). Для каждой пробы проводили не менее 15 повторов.Контролем служили интактные клетки тех же животных. Пробы крови, опытные и контрольные,красили трипановым синим для определения изменения проницаемости ЦПМ. Результатвоздействия УЗ на клетки сразу же наблюдали в световой микроскоп.

А также делали мазкиопыта и контроля и окрашивали по стандартной методике.44Кровь здоровых собак (контрольные образцы) и животных с паразитемией обрабатывалиУЗ по отработанной методике (средняя по пространству интенсивность ISATA 0.4 Вт/см2, частотамодуляции10–20 Гци 800–1000 Гц,несущаячастота0.88 МГц,продолжительностьвоздействия — 5–60 с, шаг 5 с. Использовали аппараты для УЗ терапии: УЗТ–1.01Ф и УЗТ–1.02С. Термостатирование камер для воздействие на клетки осуществлялось с помощьютермостата U7C. Выбор частот модуляции проведён экспериментальнои обусловленпоставленной задачей: изучить возможность направленного УЗ воздействия на клетки кровиживотных при моноинвазиях и смешанной инвазии ранее отработанным диапазоном частот,действующих, в основном, на нейтрофилы и эритроциты больных животных и собакс паразитемией.При определении минимального биологического порога действия УЗ на клетки кровисобак, кошек и лошадей облучали со средней по пространству и времени интенсивностью (ISATA)0.05 Вт/см2 в течение 15–30 с (шаг 2 с), используя аппараты ультразвуковой терапии УЗТ–1.01Фи УЗТ–1.02С с несущей частотой 0.88 МГц; бегущая УЗ волна, непрерывный режим, проточноеохлаждение камеры с образцами.Сыворотку крови обрабатывали УЗ по той же методике, что и кровь.

Диапазоныинтенсивностей, частот модуляции и продолжительность воздействия те же. Объём образцов 1–1.5 мл.§ 4.3. Методика воздействия на лабораторных животных in vivoСеменники лабораторных мышей облучали со средней по пространству и времениинтенсивностью 1.0 Вт/см2 непрерывным УЗ и с частотой модуляции от 10 Гц до 1000 Гц. Времяоблучения от 30 с до 5 мин, несущая частота 0.880 МГц. Аппараты: УЗТ–1.01Ф; УЗТ–5 и УЗТ–1.02С. Интенсивность УЗ, прошедшего в ткань in vivo, составляла 90% номинальнойинтенсивности. Облучение мышей проводили в специальной термостатируемой кювете притемпературе 25°C.

Поддержание постоянной температуры проводили при помощи термостата U–10. Мыши фиксировались в камере таким образом, что семенники находились в начале дальнейзоны излучателя. Экспозиция УЗ варьировала в следующих пределах: время от 1 до 300 с, SATA–интенсивность 0.05–1.0 Вт/см2, несущая частота 0.88 МГц. Контролем служила ткань без УЗвоздействия. Состояние клеток контролировали методами световой микроскопии и тестомс трипановым синим.Воздействие ультразвуком на кровь проводили в области краевой вены ушной раковиныкролика, в виде массажа вдоль сосуда в течение 30 с — 1 мин (1.0 Вт/см2, частота генерации0.88 МГц, крайние режимы модуляции 10 Гц и 1000 Гц).

Излучатель располагали строгоперпендикулярно сосуду, контактная среда — гель для УЗ терапии и диагностики. Кровь дляанализа брали из краевой вены уха в 1.5–2 см от места проведения УЗ воздействия.455. Методы анализов§ 5.1. Визуальные методы (микробиологические и гематологические)МикроскопияЗа изменением морфологии клеток в результате воздействия физического факторанаблюдали в световой микроскоп «ЛОМО» (Россия). Мазки крови просматривали подиммерсией в проходящем свете микроскопа МИКМЕД–5 (объектив 100x/1.25, окуляр 10x/18),наблюдали изменения внешнего вида клеток (размер, форма, группировка, повреждение, лизиси тому подобное). Референтный ряд клеточных размеров и нормативные показатели по всемвидам животных приведены по Н. А.

Любину [121] и Р. Кирку [94]. Фотографирование мазковкрови проводили цифровым микроскопом Electronic Magnifier (China).Определение лейкограммыПодсчёт лейкограммы проводили традиционным способом [96] в окрашенных мазкахкровиподмикроскопомс использованиемиммерсионногообъектива.Числоклеток(эритроцитов, лейкоцитов, тромбоцитов) в единице объёма крови определяли с помощью камерыГоряева и светового микроскопа. Чистые стёкла хранились до употребления в смеси Никифорова(эфир со спиртом в отношении 1:1) в банке с притёртой пробкой. Делали мазки и окрашивали пометоду быстрого дифференциального окрашивания биопрепаратов ДИФФ-КВИК: мазкификсировали в абсолютном метаноле 15 с, выдерживали в растворах красителей в течение 10 с,промывали в забуференной воде, высушивали и микроскопировали. Подсчёт лейкоцитов велиобщепринятыми методами [104].

Дифференцированный подсчёт лейкоцитов проводили методомФилипченко: в каждой части мазка (начальной, средней и конечной) микроскопировали по 30–40 лейкоцитов. Для учёта процентного количества использовали Счётчик лабораторныйлейкоцитарный С 5.Подсчёт тромбоцитов и эритроцитовМетод основан на подсчёте числа тромбоцитов в окрашенных мазках крови на 1000эритроцитов с пересчётом на 1 мкл крови, исходя из содержания в этом объёме количестваэритроцитов.Готовили тонкие мазки на обезжиренном стекле с помощью покровного или предметногостекла. Высушивали мазки на воздухе, не подогревая. Мазки фиксировали раствором МайГрюнвальда 2–3 мин.

Окрашивали раствором Романовского–Гимзы 30–45 мин. (разведение израсчёта примерно 1 капля на 1 мл дистиллированной воды устанавливали опытным путём длякаждой новой партии красителя). Для подсчёта тромбоцитов концентрация краски была вдвое46больше, чем для окраски мазка для подсчёта лейкограммы. Мазок покрывали тонким слоемкраски и оставляли на 45 мин. Затем мазок промывали под проточной водой и сушили.Высохшие мазки микроскопировали при увеличении 90 с иммерсионным объективом,подсчитывая количество тромбоцитов в тонких местах препарата. В каждом поле зрениямикроскопа считали число эритроцитов и тромбоцитов, передвигая мазок до тех пор, пока небудут просчитаны не менее 1000 эритроцитов.Количество клеток A. fischeri и H.

halobium в суспензииРасчёт числа клеток в единице объёма проводили общепринятым методом [5] в камереГоряева [104]. Об интенсивности роста культур судили также по изменению показателяоптической плотности клеток и скорости роста.Число клеток в 1 мл определяли по формуле:Xa  1000  b, где а — среднее число клеток в 4 пробах;0.90.9 — объем камеры Горяева в мм3;1000 — число мм3 в 1 см3;b — разведение суспензии.§ 5.2. Цитохимические методыТест с трипановым синимЖизнеспособность клеток до и после УЗ воздействия определяли при помощи тестас трипановым синим [181, 384, 392].

Количество жизнеспособных клеток, поделённое на общеечисло клеток, показывало процент жизнеспособности. Клетки, окрашенные трипановым синим,считались нежизнеспособными.Методика: готовили 0.4% раствор трипанового синего в фосфатно-солевом буферномизотоническом солевом растворе, pH 7.2–7.3. Добавляли 0.1 мл раствора трипанового синегок 1 мл клеток. Вносили 10 мкл окрашенной клеточной суспензии под покровное стеклои исследовали непосредственно под микроскопом при малом увеличении. Подсчитывали общееколичество клеток и количество окрашенных в синий цвет.

Трипановый синий избирательноокрашивает мёртвые клетки и повреждённые. Жизнеспособность клеток до и после УЗвоздействия определяли сразу и спустя 20 мин после обработки, так как УЗ обратимо меняетпроницаемость цитоплазматической мембраны (ЦПМ).Гематологические показатели определяли общепринятыми методами. Данные среднихзначений общеклинических показателей крови [по 94].47Окраска клеток кровиДелали мазки крови и окрашивали их по методу быстрого дифференцированногоокрашивания биопрепаратов ДИФФ-КВИК: фиксация в абсолютном метаноле 15 с, затемв растворах красителей по 10 с, промывание в забуференной воде, сушка и просмотр подиммерсией («ЛОМО» Микмед–5, объектив 100x/1.25, окуляр 10x/18).Определение противовирусной активности интерферонаПротивовирусную активность ИФН определяли при использовании 4–5-суточных культурклеток первично трипсинизированной кожно-мышечной ткани эмбрионов человека, или 1–2суточных перевиваемых диплоидных культур клеток кожно-мышечной ткани эмбрионовчеловека.

В качестве индикаторного вируса использовали вакцинный штамм «Индиана» вирусавезикулярного стоматита [108]. За противовирусную активность ИФН принимали егомаксимальное разведение, обеспечивающее защиту клеток от цитопатогенного действия вирусав 5% пробирок с культурой.§ 5.3.

Биохимические методыБелок определяли методом Лоури. Величину рH измеряли с помощью потенциометра«pH-метр 346».Препарат ИФН был получен с использованием в процессе суспензионного биосинтезаамплитудно-модулированного ультразвука терапевтической интенсивности 0.05 Вт/см2. Частотамодуляции 800 Гц, время экспозиции 30 с — 1 мин. Диапазоны воздействия подобраныэкспериментально.Методикабиосинтезалейкинферонас использованиемУЗбылаверифицирована в Институте Медико-биологических проблем РАН.Степень очистки ИФН и концентрацию иммуноглобулинов класса G (М) в полученномс помощью модулированного УЗ препарате ИФН определяли методом иммуноферментногоанализа “ELISA-тест” [70, 141] на твердофазном носителе (ELISA — enzyme–linkedimmune–sorbentassay). Метод основан на взаимодействии растворённых (солюбилизированных)иммуноглобулинов с физически адсорбированными на пластике.