Автореферат (Экспериментальный анализ функциональной активности мезенхимных стволовых клеток различного тканевого происхождения), страница 4

МСК из костного мозга, жировой ткани и пупочного канатика, одинаковоэффективно подавляли пролиферацию Т-лимфоцитов при соотношении МСК и клетокмононуклеарной фракции 1:1 и 1:10 (Рис.8).1009080706050403020100костный мозгжировая тканьпупочный канатикБ**МНК*1:1***1:10**1:100Рисунок 6. А. Пример диаграммы распределения стимулированных ФГА Т-лимфоцитов поинтенсивности флуоресценции CFSE при их сокультивировании с МСК пупочного канатика всоотношении 1:1 (1) и без сокультивирования (2). Б. Доля поделившихся Т-лимфоцитов вмононуклеарной фракции после стимуляции ФГА при их сокультивировании с МСК костногомозга, жировой ткани и пупочного канатика и без сокультивирования (МНК).

По осиординат–доля поделившихся Т-лимфоцитов относительно общего количества Т-лимфоцитов. *–данные,достоверно отличные от показателей в контроле.При соотношении 1:100, МСК костного мозга обладали менее выраженнымсупрессорным действием по сравнению с МСК жировой ткани и пупочного канатикаВлияние МСК, полученных из разных источников, на пролиферацию В-лимфоцитов.Влияние МСК на пролиферативную активность В-лимфоцитов изучено менее полно посравнению Т-лимфоцитами. Более того, накоплено значительное количество данных,противоречащих друг другу (Климович, 2014).В первой серии экспериментов – при сокультивировании МСК костного мозга,жировой ткани или пупочного канатика с клетками мононуклеарной фракции в течение72ч показано, что МСК подавляют пролиферацию В-лимфоцитов при равном11соотношении компонентов смешанной культуры.

Соотношение МСК и В-лимфоцитов приэтом составляет порядка 20:1. При уменьшении доли МСК (соотношение с клеткамимононуклеарной фракции 1:10) достоверное снижение пролиферации В-лимфоцитовнаблюдали только при сокультивировании с МСК жировой ткани и пупочного канатика, асупрессорное действие МСК костного мозга было выражено слабо (Рис.7).Доля поделившихся клеток,%Ряд1А100костный мозгжировая тканьпупочный канатикБ8060*40* *20**0МНК1:11:10Рисунок 7. А.

Пример диаграммы распределения стимулированных ЛПС лимфоцитов поинтенсивности флуоресценции CFSE при их сокультивировании с МСК пупочного канатика всоотношении 1:10 (1) и без сокультивирования (2). Б. Доля поделившихся ЛПС-стимулированныхВ-лимфоцитов при сокультивировании мононуклеарной фракции с МСК, полученными изкостного мозга, жировой ткани и пупочного канатика, и без сокультивирования (МНК).Обозначения те же, что на Рис 6.При соотношении МСК и клеток мононуклеарной фракции равном 1:100наблюдали индивидуальную вариабельность влияния МСК на пролиферацию Влимфоцитов. Не было показано корреляции между характером действия МСК на Влимфоциты и источником получения МСК, возможно, из-за небольшого количествапроанализированных культур (Рис.8).Рисунок 8.

Доля поделившихся ЛПС-стимулированных В-лимфоцитов при сокультивированииМСК костного мозга, жировой ткани и пупочного канатика (+МСК) в соотношении МСК/лейкоциты = 1:100 и без сокультивирования (МНК).Доля поделившихся клеток, %Во второй серии экспериментов, с использованием в качестве эффекторных клетокпопуляции выделенных с помощью иммунномагнитной сепарации В-лимфоцитов(чистота популяции более 95%), показано, что МСК подавляют пролиферацию Влимфоцитов только при соотношении клеток в культуре 1:1.

При увеличении доли МСК(соотношение МСК/В-лимфоциты равное 10:1) не происходило подавления пролиферацииВ-лимфоцитов, а в части экспериментов количество клеток прошедших серию удвоенийвозрастало (Рис.9.).костный мозгжировая тканьпупочный канатик10080Контроль60МСК костного мозга40МСК жировой ткани20МСК пупочного канатика0МНК10:11:11:10Рисунок 9.

Доля поделившихся ЛПС-стимулированных В-лимфоцитов при ихсокультивировании с МСК костного мозга, жировой ткани и пупочного канатика и безсокультивирования (МНК). Обозначения, как на Рис8.12Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о зависимости характеравзаимодействия МСК и В-лимфоцитов от условий постановки эксперимента: наличия всмешанной культуре других иммунокомпетентных клеток, а также соотношения МСК илимфоцитов.

При сокультивировании МСК и клеток мононуклеарной фракции всоотношении 1:100 проявлялась индивидуальная вариабельность взаимодействия культурМСК и В-лимфоцитов.Учитывая неоднородность результатов, полученных при анализе влияния МСК напролиферацию В-лимфоцитов, для оценки воздействия МСК на продукциюиммуноглобулинов В-лимфоцитами в качестве эффекторных клеток выбрали В-клеточныелинии Namalva и U266.

Их преимуществом в качестве тест-объектов, является стабильнаяпролиферация, однородность состава популяции и конститутивная продукцияиммуноглобулинов (Ig) на относительно постоянном уровне. МСК могут по-разномувлиять на продукцию Ig в лимфобластоидных (Namalva) и миеломных (U266) клетках. Налимфобластоидные клетки МСК жировой ткани и пупочного канатика оказывалистимулирующее действие, а МСК костного мозга не оказывали эффекта (Рис.10.а).Действие МСК на миеломные клетки могло проявляться как в усилении, так и вподавлении продукции IgE. Факторы, стимулирующие накопление IgE, продуцировалипролиферирующие МСК жировой ткани и пупочного канатика.

Культуры МСК из этихисточников, прекратившие пролиферацию вследствие достижения 100%-ного монослоя,оказывали слабое подавляющее действие на накопление IgE. МСК костного мозга, неоказывали влияния на уровень продукции IgE клетками линии U266 (Рисунок 10.б.).Таким образом, МСК могут по-разному влиять на продукцию Ig лимфобластоидными имиеломными клетками в зависимости от источника получения и фазы роста культурыМСК.

МСК из костного мозга, вне зависимости от фазы роста культур, не влияли насинтез IgM и IgE. Представленные результаты могут объяснять ряд имеющихся влитературе противоречий, касающихся способности МСК влиять на продукцию Igклетками B-лимфоидного ряда. В частности, расхождения в оценке действия МСКжировой ткани на содержание Ig в клетках Namalva и U266 с данными, описанными ранее(Самойлович и др., 2013), могут быть связаны с различиями в фазах роста культур МСК,численном соотношении МСК и лимфоидных клеток, а также в срокахсокультивирования.БАРисунок 10.

А.Уровень внутриклеточного IgM в клетках линии Namalva (А) и IgE в клетках линииU266 (Б) при сокультивировании с МСК в экспоненциальной (черные столбики) или стационарнойфазах роста (серые столбики). Группы столбиков: 1 – МСК костного мозга, 2 – МСК жировойткани, 3 – МСК пупочного канатика. Белые столбики – контроль. Указаны ошибки среднего.*–значения, достоверно отличные от контроля (р<0,05).При оценке влияния МСК на продукцию Ig также надо принимать во внимание, чтолимфоидные клетки, представляющие разные стадии дифференцировки, могутстимулировать МСК к выработке разных цитокинов и ростовых факторов. Этот аспектвзаимодействия МСК и B-лимфоидных клеток остается наименее изученным и требуетдальнейших исследований.Влияние МСК на аллерген-специфические реакции лейкоцитов приатопической гиперчувствительности.

Функциональную активность МСК изучали вэкспериментах, в которыхмоделировали одно из звеньев эффекторной фазыаллергическихреакцийизменениесостояниякультивируемыхклетоксенсибилизированного организма при повторном контакте с аллергеном. Клетки13мононуклеарной фракции были получены из образцов периферической крови 16 доноровс проявлениями гиперчувствительности в анамнезе. Клетки мононуклеарных фракцийпосле выделения на градиенте фиколла содержали наряду с лимфоцитами моноциты игранулоциты, т.е.

все клеточные типы, которые ответственны за появление изменений,наблюдаемых при культивировании в присутствии аллергенов.При культивировании клеток мононуклеарной фракции в течение 72 ч в присутствииспецифического аллергена в 13 образцах из 16 наблюдали рост содержания Тлимфоцитов, экспрессирующих HLA-DR+, в 1,5-3 раза. Аллогенные МСК из всехисточников предотвращали индуцированное аллергеном увеличение относительногосодержания HLA-DR+ Т-клеток.

В тех образцах, где инкубация с аллергеном не вызвалаизменения содержания активированных Т-лимфоцитов, присутствие МСК не влияло наэтот показатель. (Рис. 11.А.). Сокультивирование клеток мононуклеарных фракций с МСКиз разных источников приводило к росту количества регуляторных Т-лимфоцитов сфенотипом CD4+CD25+ CD127low (Рис.11.Б.), что также сопровождалось повышениемконцентрации IL-10 в культуральной среде. Само присутствие аллергена в лейкоцитарныхкультурах не оказывало влияния на численность Т-регуляторных клеток и концентрациюIL-10.АБ****Рисунок 11. Содержание активированных HLA-DR+ Т-лимфоцитов (А) и регуляторных Тлимфоцитов (CD4+,CD25+,CD127low) (Б) относительно Т-клеток в составе мононуклеарныхфракций после их культивирования в ростовой среде (контроль), или в среде с аллергенами(аллерген), или при сокультивировании с МСК костного мозга (МСК КМ), жировой ткани (МСКЖТ) и МСК пупочного канатика (МСК ПК) в присутствии аллергенов.

* - данные, достоверноотличные от контроля.Формирование популяции Т-регуляторных клеток под влиянием МСК можетопосредовать иммуносупрессорное действие МСК на компоненты аллергических реакций.Увеличение концентрации IL-10 является одним из возможных механизмов снижениядоли HLA-DR+ Т-лимфоцитов (Ebert et al., 2005).Внесение аллергенов в среду культивирования всех 16-ти образцов клетокмононуклеарных фракций индуцировало достоверное увеличение концентраций IL-4 иIgE. Сокультивирование лейкоцитарных фракций с МСК блокировало индуцированныеаллергенами проявления гиперчувствительности: в присутствии МСК не происходилороста концентраций IgE и IL-4 (Рис. 12.А.и 12.Б., соответственно).А*Б*Рисунок 12. Концентрация IgE (А) и IL-4 (Б) в среде после культивирования клетокмононуклеарных фракций в ростовой среде (контроль), или в среде с аллергенами (аллерген), илипри сокультивировании с МСК из разных источников в присутствии аллергенов.