Автореферат (Экспериментальный анализ функциональной активности мезенхимных стволовых клеток различного тканевого происхождения), страница 2

Показано, что в этой нише МСК содержатся в большом количестве,сопоставимом с получаемым при выделении МСК из 50-70 мл костного мозга, либо из 3-5мл жировой ткани. Количество жизнеспособных и пролиферирующих МСК, которыеможно получить из образца пупочного канатика, зависит от величины временногопромежутка между родами и началом обработки материала. Была создана иохарактеризована коллекция первичных культур МСК пупочного канатика,насчитывающая 60 образцов, которые могут быть использованы в клинической практике.Положения, выносимые на защиту1. МСК, выделенные из пупочного канатика и жировой ткани, как основа дляклеточной терапии, обладают рядом преимуществ по сравнению с МСК костного мозга.2.

Общим свойством всех МСК является их способность влиять на функциональнуюактивность лимфоидных клеток, но проявления иммуномодулирующего действия МСКзависят от параметров экспериментальных систем.3. МСК из костного мозга, пупочного канатика и жировой ткани способныингибировать проявления ряда аллерген-специфических эффекторных реакции in vitro.4. Взаимодействие МСК и клеток иммунной системы в присутствии лимфоцитарныхмитогенов сопровождается активацией в МСК сигнальных путей, опосредованныхтранскрипционным фактором NFkB.Апробация работы. Основные результаты и положения диссертации доложены иобсуждены на V Российской научно-практической конференции «Аллергические ииммунопатологические заболевания – проблема 21 века» (Санкт-Петербург, 2014),Международной научно-практической конференции «Регенеративная терапия иклеточные технологии» (Санкт-Петербург, 2013), Объединенном иммунологическомфоруме (Н.Новгород, 2013).По теме диссертации опубликовано 11 печатных работ, в том числе 4 статьи вжурналах из перечня ВАК РФ.Личный вклад автора.

Основная часть экспериментальной работы, планированиеэкспериментов, описание собственных исследований, анализ и обсуждение результатоввыполнены автором самостоятельно. Измерения концентрации цитокинов методом ИФАосуществлялись совместно с Супильниковой О.В., что нашло отражение в совместныхпубликациях.Мононклональныеантителадлявыявлениявнутриклеточныхиммуноглобулинов были получены из Лаборатории гибридомной технологии ФГБУРНЦРХТ.Структура и объем диссертации.

Диссертация изложена на 158 страницахмашинописного текста и включает: введение, обзор литературы, описание материалов иметодов, изложение полученных результатов и их обсуждение, выводы и списоклитературы. Текст диссертации, сопровождается 54 рисунками и 6 таблицами. Списоклитературы содержит 297 источника, из них 281 на иностранном языке.ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫМатериалы и методы исследований. Получение, культивирование иморфологическая характеристика МСК. Образцы костного мозга, жировой ткани ипупочного канатика получали при наличии информированного согласия доноров.Костный мозг получали в ходе пункции подвздошной кости у здоровых доноров (12человек). Фракцию мононуклеарных клеток выделяли центрифугированием на градиентефиколла.

Клетки переносили в полную ростовую среду, которая состояла из Advanced5Stem Media и 20 % заменителя сыворотки HyClone, затем высевали во флаконы приплотности 100-200 тыс. кл/см2. Неприлипающие клетки удаляли через 3 суток.Образцы подкожной жировой ткани были получены от 13 здоровых доноров. Тканьмеханически измельчали, затем инкубировали в растворе коллагеназы I типа.Диссоциированные клетки переносили в полную ростовую среду и высевали во флаконыпри плотности 100–200 тыс.

кл/см2. Неприлипающие клетки удаляли через 24 ч.Образцы пупочных канатиков были получены при неосложненных родах. Сосудыканатика промывали раствором Версена, заполняли 0,2 % раствором коллагеназы IV типа,промывали и повторно заполняли раствором коллагеназы, затем клеммировали с двухсторон и инкубировали в течение 30 мин при 37 ºС. Полученную взвесь клеток отмывалиот фермента центрифугированием (400 g, 10 мин) и высевали во флаконы при плотности100–400 тыс. кл/см2. Смену среды проводили через 3 сут. Было проанализировано 78культур МСК, полученных из пупочного канатика.При достижении 70–80 % конфлюентности монослоя МСК снимали с поверхностираствором трипсин-версена и пересевали при плотности 5 тыс. кл/см2.

Клеткикультивировали при 37оС в атмосфере 5% СО2 и 20% (условия нормоксии) или 5% О2(условия гипоксии) с использованием мультигазовых инкубаторов (BBD 6220, ThermoScientific, США).Поверхностные маркеры МСК выявляли с помощью меченных флуорохромамиантител против CD34, CD45, CD90, CD105 и CD73 на проточном цитофлуориметре FC500(Beckman Coulter, США) в соответствии с инструкцией производителя. Анализполученных данных проводили с помощью программного обеспечения СХР.Подсчет клеток, определение их жизнеспособности и средних размеров осуществлялина автоматическом счетчике частиц (Beckman Coulter, США).

Морфологическуюхарактеристику МСК проводили с использованием программы CapturePro v2.8.8. прианализе фотографий случайно выбранных полей зрения, полученных с использованиемсветового инвертированного микроскопа Axiovert 40C, оснащенного системой анализаизображения Progress CT3 (Zeiss, Германия).Для оценки пролиферативной активности МСК определяли среднее время удвоенияпопуляции Td по формуле Td=(log22)*t/[log2(Nt/N0)], где t – время прироста популяции, Nt– количество клеток через время t, N0 – исходное количество клеток.Получение и активация клеток мононуклеарной фракции. В исследованиииспользовали образцы венозной крови 5 здоровых доноров, а также 16-ти доноровдобровольцев, в анамнезе которых были зафиксированы клинические проявлениягиперчувствительности (аллергический ринит, атопический дерматит, острая крапивница,гастроэнтерологические расстройства, атопическая бронхиальная астма, анафилаксия).

В4-х случаях реакции развивались после приема пищевых продуктов, в 3-х – послеприменения лекарственных препаратов, в остальных – после контакта с бытовыми и спыльцевыми аллергенами (4 и 5 случаев соответственно). Все доноры в момент сбораобразцов крови находились в состоянии ремиссии и не имели клинических проявленийаллергических реакций. Клетки мононуклеарной фракции выделяли на градиенте фиколлапо стандартной методике. Клеточный состав лейкоцитарной фракции определяли спомощью гематологического анализатора Beckman-Coulter ACT Diff2.В-клеточные линии Namalva и U266 были были получены из Коллекции клеточныхкультур ИНЦ РАН.

Клетки выращивали в среде IMDM с добавлением 7 % сывороткиэмбрионов коров HyClone.Сокультивирование МСК и клеток мононуклеарной фракции периферической крови.Использовали культуры МСК 2-3 пассажей, в фазе логарифмического роста (30-60%конфлюентности). Для этого МСК рассевали в ячейки 6-луночного планшета по 30 тыскл/см2, через 24 ч в те же ячейки вносили разное количество клеток мононуклеарнойфракции. Растворы аллергенов, либо ЛПС, либо ФГА вносили одновременно с началом6сокультивирования МСК и мононуклеаров. Сокультивирование проводили в среде RPMI с10% сыворотки эмбрионов коров.Сокультивирование МСК и клеток линий Namalva либо U266.

МСК рассевали в лунки6-ти луночного планшета в концентрации 10 или 60 тыс кл/см2 в зависимости оттребуемой плотности культуры. Через сутки в лунки с МСК вносили клетки линииNamalva либо линии U266. Сокультивирование проводили в среде IMDM с добавлением7% сыворотки эмбрионов коров в течение 72 ч. Контролем служили клетки линийNamalva и U266, культивируемые без МСК.Оценка пролиферации лимфоцитов. Определение количества делений лимфоцитовпроводили с помощью окраски витальным красителем карбоксифлуоресцеинсукцинимидным эфиром (CFSE).

Количество поделившихся клеток оценивали поизменению интенсивности флуоресценции CFSE после окончания культивирования спомощью проточного цитофлуориметра FC500 (Beckman Coulter).Иммунофенотипирование лимфоцитов. С помощью проточной цитофлуорометриивыявляли популяции B-лимфоцитов (CD19+), естественных киллеров (CD3-, CD16+,CD56+), Т-лимфоцитов (CD3+, CD4+), а также регуляторных Т-клеток (CD3+, CD4+,CD127low) и Т-лимфоцитов, экспрессирующих ранний (CD69+) и поздний (HLA-DR)маркеры активации. Анализ выполняли на проточном цитофлуориметре FC500 (BeckmanCoulter, США).

Все эксперименты были поставлены в 4 повторностях.Иммуноферментный анализ. Определение концентрации IgE и цитокинов IL-4, IL-10,IL-6 в культуральной среде проводили методом твердофазного иммуноферментногоанализа (ИФА) с помощью коммерческих наборов (Вектор-Бест, Россия) согласноинструкции производителя.Оценку уровня продукции иммуноглобулинов в В-клеточных линиях осуществляли спомощью проточной цитофлуорометрии с окраской иммуноглобулинов меченнымифлуоресцеиноммоноклональными антителами, полученными в лабораториигибридомной технологии ФГБУ РНЦРХТ. Для детекции IgE в клетках линии U266использовали антитела E-5D4, для определения IgM в клетках линии Namalva – антителаM-2В9. Для сравнения результатов сокультивирования были использованы средниезначения интенсивности флуоресценции в относительных единицах (Хсредн). Каждыйвариант сокультивирования проводили в четырех повторах.Иммунофлуоресцентная микроскопия МСК высевали в концентрации 10 тыс кл/см2 влунки 6-ти луночных планшетов, на дно которых помещали покровные стекла.Сокультивирование с клетками мононуклеарной фракции проводили, как описано выше, втечение 30, 60, 90, 180 мин или 24 ч в присутствии ФГА (10 нг/мл), ЛПС (10 нг/мл) илисоответствующего анамнезу донора периферической крови аллергена.