Автореферат (Экспериментальный анализ функциональной активности мезенхимных стволовых клеток различного тканевого происхождения), страница 5

Обозначения какна Рис.11.1410-1контрольаллерген543ФГАКонцентрация ИЛ-4, пг/мл2Концентрация ИЛ-4, пг/млКонцентрация ИЛ-4, пг/млВ тоже время, при воздействии ФГА на клетки мононуклеарной фракции,сокультивирование с МСК приводило к незначительному увеличению концентрации IL-4МНК костный мозг жировая ткань пупочный канатикв культуральной среде в экспериментах с материалом всех доноров (Рис.13).5*4*МНК костный мозг жировая ткань пупочны* *.*3МНК костный мозг жировая ткань пупочный канатик5432Рисунок 13. Содержание IL-4 при сокультивировании МСКиз костного мозга, жировой ткани и12пупочного канатика, с клетками мононуклеарной фракции периферической крови в присутствии01 от контроля (Р<0,05).ФГА.

* - данные, достоверно отличныеконтрольаллергенMFI, отн.ед.-10Таким образом, МСК предотвращалиувеличениеконцентрации IL-4 приконтрольаллергенФГА в присутствиистимулировании лимфоцитов аллергеном,нонеподавлялипродукциюIL-4-1ФГА. Характер влияния МСК на уровень продукции IL-4 зависит от стимулирующегоагента, предъявляемого иммуннокомпетентным клеткам.Суммируя представленные результаты, можно сделать вывод, что проявлениеиммуномодулирующих свойств МСК в целом сходны у клеток из разных источников.Различия, обусловленные тканевой принадлежностью или индивидуальнымиособенностями донора, наблюдали относительно влияния МСК на пролиферацию Т- и Влимфоцитов при низкой концентрации МСК, продукцию иммуноглобулинов Вклеточными линиями и изменение концентрации IL-10. МСК из костного мозга имелименее выраженное влияние, чем МСК пупочного канатика и жировой ткани.Влияние клеток мононуклеарной фракции и лимфоцитарных митогенов нафункциональное состояние МСК.

В последние годы появился ряд работ, согласнокоторым, взаимодействие МСК с иммунокомпетентными клетками сопровождаетсявключением в МСК сигнальных путей, опосредованных Toll-подобными рецепторами(TLR) и транскрипционным фактором NFkB (Dorronsoro et al., 2014; Romieu-Mourez et al.,2009). Изменение функционального состояния МСК оценивали по уровню экспрессииTLR3 и TLR4, характеру внутриклеточного распределения NF-κB с помощью методовпроточной цитофлуорометрии и иммуноцитохимии.Экспрессия Toll-подобных рецепторов на мембране МСК. МСК из разных источниковхарактеризуются низким уровнем экспрессии TLR4, что было показано методомпроточной цитофлуорометрии (Рис.14.).

МСК конститутивно экспрессируют TLR3.Уровень экспрессии TLR3 на поверхности МСК выше, чем на поверхности лимфоцитовпериферической крови35(CD45+)(Рис.14.а).костныймозгжиров ая тканьпупочный канатик*30** * *Контроль*АБ25МСК костного мозга20* **МСК жировой ткани15МСК пупочного канатика1050контрольФГАЛПСМНКМНК+ФГА МНК+ЛПСРисунок 14. А.

Гистограмма интенсивности флуоресценции МСК костного мозга (черная линия) илимфоцитов периферической крови (гистограмма с серым фоном), экспрессирующих TLR3.Пунктирная линия – изотипический контроль. Б. Средняя интенсивность флуоресценции МСК,экспрессирующих TLR3, в присутствии митогенов (ЛПС либо ФГА), либо при сокультивированиис интактными лейкоцитами (МНК) или митоген-активированными лейкоцитами. Указаностандартное отклонение. * – достоверные различия от контроля при р<0,05.15ФГАПоказано индуцибельное усиление экспрессии TLR3 на поверхности МСК.

Наибольшееувеличение средней интенсивности флуоресценции МСК, экспрессирующих TLR3,наблюдали при их сокультивировании с клетками мононуклеарной фракции вприсутствии лимфоцитарных митогенов: ФГА или ЛПС. Воздействие ЛПС намонокультуру МСК также приводило к увеличению интенсивности флуоресценции МСК,экспрессирующих TLR3, на 29,5±11,3 %. Уровень экспрессии TLR3 и степень егоизменения не зависели от источника МСК. (Рис.14.б)Анализ локализации транскрипционного фактора NFkB в МСК. Анализировалиизменение локализации транскрипционного фактора NF-kB в МСК присокультивировании с активированными ФГА или ЛПС клетками мононуклеарнойфракции.

Контролем служили монокультуры МСК, которые инкубировали с ФГА или сЛПС. В интактных МСК NFkB находится в цитоплазме и не обнаруживается в ядре(Рис.15).Рисунок 15. Распределение транскрипционного фактора NFkB в интактных МСК. Краснымотмечены структуры актинового цитоскелета, окрашенные родамин-фаллоидином (RhPH),зеленым – антитела к субъединице p65 и вторые антитела, конъюгированные с флуорохромомAlexa-488, синим – ядра клеток, окрашенные DAPI. Флуоресцентная микроскопия. Масштабныйотрезок – 10 мкм.24 ч30 минКонтактное сокультивирование МСК с интактными лимфоцитами не индуцировалотранслокацию NFkB в МСК.

Ядерный импорт транскрипционного фактора наблюдали подвлиянием ЛПС. Через 30 мин инкубации МСК с ЛПС NFkB был локализован в ядре вовсех клетках, после 24 ч ядерная локализация NFkB сохранялась в 80% МСК (Рис.16.).Рисунок 16. Локализация транскрипционного фактора NFkB в МСК при инкубации с ЛПС втечение 30 мин и 24ч. Масштабный отрезок – 5 мкм.

Обозначения как на Рис. 15.Воздействие ФГА также вызывало транслокацию NFkB в ядро МСК в течение 30 мин.Кроме того, при инкубации с ФГА наблюдали обратимую перестройку актиновогоцитоскелета в течение 15-30 минут, а также изменение морфологии клеток (Рис.17.).После 24 ч инкубации с ФГА ядерная локализация NFkB сохранялась в 60% МСК.Рисунок 17. Локализация транскрипционного фактора NFkB в МСК при инкубации с ФГАв течение 24 ч.

Масштабный отрезок – 5 мкм. Обозначения те же, что на Рис. 15.При контактном сокультивировании МСК и активированных митогеном (ФГА илиЛПС) клеток мононуклеарной фракции через 30 минут NFkB обнаруживали в ядре в 30%популяции МСК (у 70% МСК транскрипционный фактор оставался в цитоплазме).Транлокация NFkB в ядро во всех клетках завершалась через 60-90 мин (Рис.18.).16132412490 мин30 мин3Рисунок 18.

Распределение NFkB в МСК при контактном сокультивировании с лейкоцитами вприсутствии ЛПС в течение 30 мин и 90 мин. Стрелками показаны лимфоциты на поверхностиМСК. 1,2 – ядра МСК, в которых завершилась транслокация NFkB в ядро, 3,4 – ядра МСК, вкоторых NFkB локализован преимущественно в цитоплазме. Обозначения те же, что на Рис. 15.Таким образом, воздействие ЛПС – лиганда TLR4 – вызывает транслокацию NFkB вядро МСК. Аналогичный процесс наблюдали при инкубации с ФГА – митогеном Тлимфоцитов, который также может выступать в качестве лиганда TLR4 (Unitt et al., 2011).Однако, как было описано выше, TLR4 на поверхности МСК является трудно-детектируемым спомощью проточной цитофлуорометрии, что свидетельствует об очень низкой плотности этогорецептора на поверхности МСК, что, возможно компенсируется высоким аффинитетомсвязывания TLR4 c ЛПС.

В свою очередь ФГА частично может взаимодействовать сгетеродимером TLR2/6 (Unitt et al., 2011), который экспрессируется в МСК (Grote et al., 2013).При сокультивировании с активированными ЛПС или ФГА клетками мононуклеарнойфракции транслокация NFkB в МСК происходит значительно позже, что можетсвидетельствовать об активации NFkB-опосредованных сигнальных путей в МСК в ответна медиаторы, продуцируемые иммуннокомпетентными клетками.

Для проверки такогопредположения локализацию NFkB в МСК анализировали при воздействии TNFα. TNFαиндуцировал импорт транскрипционного фактора в ядро в течение 30 минут после началавоздействия. Ядерная локализация сохранялась в течение 4 часов, после чего NFkB2 Перераспределение NFобнаруживался преимущественно в цитоплазме клеток (Рис.19).κB в МСК происходило одинаково во всех проанализированных культурах МСК,30 минполученныхиз костного мозга, жировой ткани, и пупочногоканатика. Временные12 ч30мин12ч1ч4ч30 мин1чРисунок 19. Распределение NFkB в МСК при инкубации с TNFα.

Обозначения как на Рис. 15.интервалы, в которые наблюдали транслокацию NF-κB, также были схожими для всехкультур МСК. Изменение функционального состояния МСК непосредственно подвлиянием как ЛПС, так и ФГА, может являться одним из вероятных объясненийрасхождения результатов, полученных in vitro при сокультивировании МСК симммунокомпетентными клетками, стимулированными различными стимулами, а также сданными о процессах, происходящих под воздействием на МСК отдельныхпровоспалительных цитокинов.Локализацию NFkB в МСК анализировали также в смешанной культуре состимулированными специфическими аллергенами клетками мононуклеарной фракциикрови пациентов с проявлениями гиперчувствительности. В течение всего процессасокультивирования, транскрипционный фактор NFkВ был локализован в цитоплазме МСК(Рис.

20.). При этом проанализированные культуры МСК ингибировали проявленияаллерген-специфических эффекторных реакций в условиях in vitro.Рисунок 20. Локализация NFkB в МСК при сокультивировании с лейкоцитами в присутствииаллергена в течение 90 мин. Обозначения те же, что на Рис. 15.17Таким образом, модуляция МСК активности аллерген-активированных лимфоцитовпроисходит с вовлечением сигнальных путей, не связанных с транскрипционнымфактором NFκB. Наши наблюдения могут быть свидетельством того, что лабильностьиммуномодулирующего действия МСК обусловлена активацией в них различныхсигнальных путей под воздействием соответствующих медиаторов, продуцируемыхиммуннокомпетентными клетками.Заключение. Сравнение костного мозга, жировой ткани и периваскулярногопространства пупочного канатика по количеству выделяемых из них МСК и иххарактеристикам показало, что использование пупочного канатика как источника МСКимеет ряд преимуществ.

Это связано с тем, что для получения пупочного канатика нетребуется инвазивных процедур, при этом периваскулярное пространство пупочногоканатика характеризуется высоким содержанием МСК, которые обладают большимпролиферативным потенциалом, чем МСК из других источников. В использованныхэкспериментальных моделях было показано, что функциональная активность МСКпупочного канатика относительно лимфоидных клеток сходна с МСК жировой ткани и вчасти экспериментальных систем превышает таковую МСК костного мозга.Проявление функциональной активности МСК по отношению к компонентамиммунной системы зависит от ряда факторов.

Учитывая лабильность взаимодействияМСК и эффекторных клеток, можно говорить о том, что многочисленные данные,накопленные в литературе на данный момент, могут рассматриваться не какпротиворечащие, а как дополняющие друг друга. Поэтому использование различныхэкспериментальных систем как in vitro, так и in vivo при исследовании функциональнойактивности МСК является необходимым для эффективного и безопасного примененияМСК в клинической практике. При этом необходима разработка функциональных тестовдля культур МСК в зависимости от нозологии, при которой планируется их применение.Подобные тесты необходимо проводить с клеточным материалом конкретного пациента,для которого планируется такое лечение.ВЫВОДЫ1. Из периваскулярного пространства пупочного кантика и жировой ткани можнополучить МСК в большем количестве и с более высоким пролиферативным потенциалом,чем из аспирата костного мозга.2. Культуры МСК из костного мозга, жировой ткани и пупочного канатика сходны поморфологическим признакам, обладают одинаковым содержанием клеток, несущих МСКассоциированные маркеры, за исключением CD10 и CD13, но отличаются по уровнюэкспрессии CD90.3.