Автореферат (Экспериментальный анализ функциональной активности мезенхимных стволовых клеток различного тканевого происхождения)

На правах рукописиАЙЗЕНШТАДТ АЛЕКСАНДРА АНДРЕЕВНАЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЙ АНАЛИЗ ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ АКТИВНОСТИМЕЗЕНХИМНЫХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК РАЗЛИЧНОГО ТКАНЕВОГОПРОИСХОЖДЕНИЯ03.03.04 – клеточная биология, цитология, гистологияАВТОРЕФЕРАТдиссертации на соискание ученой степеникандидата биологических наукСанкт-Петербург2015Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном образовательномучреждении высшего профессионального образования «Санкт-Петербургскийгосударственный университет»Научный руководитель:Доктор биологических наукСамойлович Марина Платоновна, ведущийнаучный сотрудник Лаборатории гибридомнойтехнологии ФГБУ «Российский научный центррадиологии и хирургических технологий» МЗ РФ(г. Санкт-Петербург).Официальные оппоненты:Доктор медицинских наукГалагудза Михаил Михайлович, директорИнститута экспериментальной медицины ФГБУ«Северо-Западный федеральный медицинскийисследовательский центр имени В.

А. Алмазова»МЗ РФ (г. Санкт-Петербург)Кандидат биологических наукАлексеенко Лариса Леонидовна, младшийнаучный сотрудник отдела внутриклеточнойсигнализации и транспорта ФГБУН Институтцитологии Российской академии наук (г. СанктПетербург)Ведущая организация:Федеральное государственное бюджетное научное учреждение «Институтэкспериментальной медицины», г.

Санкт-ПетербургЗащита диссертации состоится « » __________ 2015 г. вчасов на заседании советаД 212.232.12. по защите докторских и кандидатских диссертаций при ФГБОУ ВПО«Санкт-Петербургский Государственный университет» по адресу: 199034, г. СанктПетербург, Университетская наб., д. 7/9, СПбГУ, биологический факультет.С диссертацией можно ознакомиться в центральной библиотеке им. М.

Горького СанктПетербургского Государственного университета и на сайте Санкт-Петербургскогогосударственного университета (http://spbu.ru/).Автореферат разослан « » _______________ 2015 г.Ученый секретарьДиссертационного совета Д 212.232.12доктор биологических наукЛюдмила Андреевна Мамон2ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫВведениеМезенхимные стромальные (стволовые) клетки (МСК) – это недифференцированныеклетки, происходящие из мезодермального зародышевого листка, обладающиеспособностью к самоподдержанию популяции и дифференцировке в клетки мезенхимногоряда (Deans et al., 2000; Rossant, 2001).Впервые МСК были описаны как клетки костного мозга с фибробласто-подобнойморфологией, способные прикрепляться к поверхности культурального пластика иформировать колонии in vitro, а также дифференцироваться в адипогенном, хондрогенноми остеогенном направлениях (Фриденштейн и др., 1968; Pittenger et al., 1999).

В болеепоздних работах также была продемонстрирована способность МСК дифференцироватьсяв клетки эндотелия (Oswald et al., 2004), кардиомиоциты (Tokcaer-Keskin et al., 2009),нейроны и астроциты (Jori et al, 2005).В целостном организме МСК выполняют гомеостатические функции и служат длявосполнения утраченных элементов кровеносных сосудов и опорно-двигательногоаппарата, для заживления ран, для построения сосудистой сети плода и плаценты(Паюшина, 2015; Bielby et al., 2007; Glenn et al., 2014). Осуществление перечисленныхфункций МСК обеспечивается экспрессией генов, кодирующих широкий спектрадгезионных молекул, цитокинов, хемокинов и их рецепторов. Таким образом, МСКгенетически детерминированы к процессам миграции, взаимодействия с другимиклеточными элементами и межклеточным матриксом.

При перемещении по сосудистомуруслу и в интерстициальных пространствах МСК контактируют как с подвижнымиклетками (например, лейкоцитами), так и с резидентными элементами (эндотелиоцитами,фибробластами, межклеточным матриксом). Взаимодействия с ними требуют реализацииразличных программ миграции, пролиферации и дифференцировки.С этими свойствами, а также с возможностью культивирования МСК in vitro, связаноих интенсивное изучение и применение в качестве основы для клеточной терапииразличных заболеваний. В международной базе клинических испытаний на данныймомент зафиксировано более 450 исследований с использованием МСК(https://clinicaltrials.gov).

Результаты мета-анализа проводимых клинических исследованийсвидетельствуют об отсутствии серьезных побочных эффектов при введении МСК (Lalu etal., 2012). Несмотря на наличие многообещающих результатов доклинических иограниченных клинических исследований, анализ действия МСК по сравнению с плацебодля большой выборки пациентов (III/IV фазы клинических испытаний) не далоднозначных результатов об эффективности их применения, в частности, для леченияреакции трансплантат против хозяина (РТПХ) (Galipeau, 2013).

Недостаточно высокаяэффективность клинического применения МСК во многом обусловлена нехваткой знанийо свойствах МСК, а также неразработанностью методов предварительного тестированияклеток в соответствии с целями их использования.На сегодняшний день дискуссионными остаются вопросы о значимости различий всвойствах МСК, обусловленных характеристиками ткани, из которой были выделеныклетки, а также индивидуальными особенностями донора биологического материала(Крылова и др., 2014; Payne et al., 2013; Rebelatto et al., 2008; Siegel et al., 2013). В течениеболее чем 30 лет после открытия основным источником материала для исследований МСКоставался костный мозг человека и лабораторных животных, но, начиная с конца 90-хгодов 20 века, клетки с характеристиками, соответствующими МСК, были найдены вбольшинстве органов млекопитающих.

Последнее время все больше вниманияисследователей привлекают МСК, выделенные из жировой ткани (Zuk et al., 2002), изплаценты (Fukuchi et al., 2004) и ткани пупочного канатика (Covas et al., 2003; Wang et al.,2004).3Логически МСК, находящиеся в столь разных с физиологической точки зрения нишах,должны были бы различаться набором важных биологических характеристик. Тем неменее, при изучении МСК, выделенных из разных тканей, отмечали несомненноесходство между ними по экспрессии мембранных антигенов, по пролиферативному идифференцировочному потенциалу (Covas et al., 2008; Musina et al., 2005; Vishnubalaji etal., 2012). Вместе с тем функциональные особенности МСК различного тканевогопроисхождения остаются малоизученными.Цель настоящей работы состояла в том, чтобы в пределах одного исследования, спомощью стандартизованных методических приемов сравнить функциональныехарактеристики МСК, выделенных из костного мозга, жировой ткани и пупочногоканатика человека.В соответствии с указанной целью в работе были поставлены следующие задачи:1.

Получить первичные культуры МСК из костного мозга, жировой ткани ипериваскулярного пространства пупочного канатика человека и сравнить их ростовыехарактеристики.2. Сопоставить иммунофенотипичесикие характеристики МСК, выделенных изуказанных источников.3. Изучить функциональную активность МСК из разных источников в системахконтактного сокультивирования с Т-лимфоцитами.4. Исследовать проявления функциональной активности МСК по отношению к Влимфоидным клеткам.5. Изучить влияние МСК из разных источников на аллерген-специфическиеэффекторные реакции в модельной системе in vitro.6. Оценить изменение функционального состояния МСК при их взаимодействии симмунокомпетентными клетками и под влиянием лимфоцитарных митогенов.Научная новизна Основной особенностью проведенного исследования являетсясопоставлениеморфо-функциональныхсвойствМСКразличноготканевогопроисхождения с использованием набора методических приемов в стандартизованныхэкспериментальных условиях.Оценку морфологических, иммунофенотипических и ростовых характеристикпроводили на большой выборке клеточных культур МСК костного мозга, жировой ткании пупочного канатика.

Это позволило сделать вывод о более высокой пролиферативнойактивности МСК пупочного канатика по сравнению с МСК костного мозга, а такжевыявить различия в экспрессии CD10, CD13, CD90 и CD105 на поверхности МСК взависимости от их тканевого происхождения.Анализ функциональной активности МСК из разных источников вэкспериментальных системах с использованием в качестве тест-объектов Т- и Влимфоцитов, либо В-лимфоидных клеточных линий показал меньшую выраженностьиммуномодулирующего действия МСК костного мозга, по сравнению с МСК жировойткани и пупочного канатика.

В модельных экспериментах in vitro былопродемонстрировано супрессорное влияние МСК различного тканевого происхожденияна аллерген-специфические реакции лимфоидных клеток. Кроме того, было показано, чтоМСК оказывают разнонаправленное действие на продукцию IL-4 в зависимости отстимулирующего агента, предъявляемого иммуннокомпетентным клеткам, исоответственно, типа иммунного ответа.Впервые проведено сопоставление изменения функционального состояния МСК подвоздействием лимфоцитарных митогенов и стимулированных этими митогенамилимфоидных клеток. Были описаны эффектыпрямого действия на МСК Тлимфоцитарного митогена ФГА.Теоретическая и практическая значимость работы.

Использование разныхусловий сокультивирования клеток позволило определить параметры экспериментальныхсистем, которые являются значимыми для выявления различий в свойствах МСК,4обусловленных индивидуальными особенностями доноров. Полученные данные могутбыть использованы в качестве основы для создания алгоритмов контроля качества МСКконкретных пациентов/доноров, включающих в себя оценку функциональной активностиэтих клеток.Результаты работы свидетельствуют о том, что МСК периваскулярного пространствапупочного канатика могут являться перспективным источником для клиническогоприменения.