Автореферат (1145848), страница 3
Текст из файла (страница 3)
Для определениялокализации в МСК субъединицы р65/RelA транскрипционного фактора NFkB препаратыпоследовательно инкубировали с первыми кроличьими поликлональными антителамипротив р65 субъединицы NF-кВ (Abcam, США) в течение 45 мин и вторыми антителами,конъюгированными с флуорохромом Alexa 488 (козьи антитела к иммуноглобулинамкролика; Abcam, США) в течение 60 мин, после каждой инкубации стекла промывали 0,1% Tween в ФСР.
Для выявления структуры актинового цитоскелета распластанных клетокпроводили окраску родамин-фаллоидином (Sigma, USA) Препараты анализировали спомощью флуоресцентного микроскопа AxioScope A1 (Zeiss, ФРГ).Статистическая обработка результатов. Статистическую обработку результатовпроводили с использованием программ “Excel” для WinXP и Graph Pad Prism 5.0. Вкачестве характеристик использовали среднее и стандартное отклонение. В экспериментахпо изучению влияния МСК на аллерген-специфические реакции лейкоцитов оценивалимежгрупповые различия с помощью U критерия Манна-Уитни при выбранном уровнезначимости p< 0,05.7РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕХарактеристика МСК костного мозга, жировой ткани и пупочного канатика.В пупочном канатике выделяют 2 ниши МСК: Вартонов студень и периваскулярноепространство пупочной вены.
МСК, полученные из этих ниш представляют две отдельныепопуляции с различными свойствами (Carvalho et al., 2011; Ishige et al., 2009). Изпериваскулярного пространства после 1 пассажа возможно получение в среднем 3,1 млнМСК (с минимумом – 0,7 и максимумом – 5,4) на каждые 10 см длины образца.Получение жизнеспособных и пролиферирующих МСК из пупочного канатика возможнов течение 24 после родов, но их количество снижается при транспортировке образца более12 ч. В тоже время количество МСК не зависело от возраста роженицы и срока гестации(37-41 неделя).Известно, что во всех тканях, из которых были получены МСК, концентрациякислорода ниже, чем в атмосфере (Pasarica et al., 2009; Simon et al., 2008; Snow et al., 2002).Поэтому исследование характеристик МСК также целесообразно проводить припониженном содержании кислорода.
В ходе серии предварительных экспериментов былопоказано, что культивирование МСК из разных источников в условиях гипоксии приводитк повышению их пролиферативного потенциала (Рис. 1.) при сохраненииморфологических характеристик клеток.АБВРисунок 1. Среднее время удвоения популяции МСК, полученных из костного мозга (А), жировойткани (Б) и пупочного канатика (В), при их культивировании в условиях гипоксии (светло-серыестолбцы) и нормоксии (темно-серые столбцы). По оси абсцисс – количество пассажей, по осиординат – время удвоения популяции.
Указано стандартное отклонение.МСК из пупочного канатика, обладают большей пролиферативной активностью, чемМСК костного мозга. Аналогичные результаты были получены ранее (Baksh et al., 2007).При длительном культивировании показано, что МСК пупочного канатика на позднихпассажах (с 6 пассажа) характеризовались меньшим временем удвоения популяции, чемМСК жировой ткани. Пролиферативная активность МСК пупочного канатика сохраняласьв течение максимального количества пассажей по сравнению с МСК, полученными издругих источников. Время удвоения популяции МСК пупочного канатика дляпроанализированных культур было практически одинаковым на 3-5 пассажах, но с 6пассажа существенно различалось между культурами, полученными от разных доноров(от 52 до 194 ч) (Рис.1.).
МСК, полученные из костного мозга, жировой ткани и пупочногоканатика, характеризовались способностью дифференцироваться в остеогенном,хондрогенном и адипогенном направлениях.При иммунофенотипировании клеточных культур МСК костного мозга (25 образцов),жировой ткани (13) и пупочного канатика (32) показано что, процентное содержаниеклеток, экспрессирующих антигены CD90, CD105, CD44, CD73, и отрицательных поэкспрессии CD45, CD34, CD117, CD14, во всех культурах превышало 90%.
МСКпупочного канатика на ранних пассажах были гетерогенны по экспрессии CD10(нейтральная эндопептидаза) и CD13 (аминопептидаза N) – в популяции присутствовалозначительное количество клеток, не экспрессирующих эти антигены (Таблица 1.). Придальнейшем культивировании (с 3 пассажа) CD10 и CD13 экспрессировали 83 ± 10% и 71± 12,5 % клеток, соответственно. CD10 и CD13 вовлечены в регуляцию миграции иклеточной адгезии (Mina-Osorio et al., 2008; Subramani et al., 2013; Sumitomo et al., 2005),способность к которым является значимой при системном применении МСК.8Таблица 1. Доля клеток, экспрессирующих поверхностные антигены, в культурах МСК (2пассаж), полученных из разных источников.АнтигенСD90+CD 105+CD 73+CD 10+CD 13+CD 44+HLA-ABCCD 45CD14CD117CD34-Источник МСКЖировая ткань99,3 ± 0,499 ± 0,898,2 ± 0,681 ± 13,597,3± 2,199,8 ± 0,0599,8 ± 0,12,5 ± 1,22,4 ± 1,61,8 ± 0,53,4 ± 2,1Пупочный канатик99,2 ± 0,599,7 ± 0,299,3 ± 0,757,8 ± 17,134,6 ± 14,599 ± 0,999,5 ± 0,23 ± 2,43,8 ± 3,54,2 ± 3,82,1 ± 1,8Костный мозг99 ±0,499,3 ± 0,590 ± 6,298 ± 0,996,1 ± 1,997.5 ± 2,399,2 ± 0,11,9 ± 1,61,5 ± 0,81,1 ± 0,43,1 ± 2,8Полужирным шрифтом выделены маркеры, по экспрессии которых выявлены достоверные различиямежду МСК пупочного канатика и МСК, выделенными из жировой ткани и костного мозга.Для проверки представления о низком уровне экспрессии HLA I на МСК (Климович,2014; Franquesa et al., 2012; Newman et al., 2009) сравнивали среднюю интенсивностьфлуоресценции МСК жировой ткани и лимфоцитов периферической крови, полученныхот одних и тех же доноров (3 здоровых донора).
Средняя интенсивность флуоресценцииМСК и лимфоцитов периферической крови, экспрессирующих HLA I, практически неотличается (Рис.2.), что согласуется с работой Crop с соавторами, в которой высокийуровень экспрессии HLA I в МСК был продемонстрирован с помощью микрочипов (Cropet al., 2010).БАЕдиницы относительнойэкспрессии, %Рисунок 2. Уровень экспрессии HLA I на МСК и лимфоцитах периферической крови. А Гистограмма интенсивности флуоресценции МСК жировой ткани (гистограмма с серым фоном) илимфоцитов периферической крови (черная линия), экспрессирующих HLA I.
Пунктирная линия– изотипический контроль. Б – Средняя интенсивность флуоресценции МСК и лимфоцитовпериферической крови. Указано стандартное отклонение.400400450400350200150жировая тканьпупочный канатик300300**** * ** * *20020010010000300250костный мозгЛПСФГАлейкоцитылейкоциты+ЛПСлейкоциты+ЛПСФНОαРисунок 3. Изменение средней интенсивности флуоресценции культур МСК, экспрессирующихHLA I, в присутствии митогенов (ЛПС и ФГА), либо ФНОα, либо при сокультивировании синтактными лейкоцитами или митоген-активированными лейкоцитами. По оси ординат отложеныизменения средней интенсивности флуоресценции относительно значений в контроле, принятыхза 100%.
Указано стандартное отклонение.* – достоверные различия от контроля при р<0,05.1005090ЛПСФГАлейкоцитылейкоциты+ЛПСлейкоциты+ФГАФНОαСредняя интенсивностьфлуоресценции, отн.едУровень экспрессии HLA I на поверхности МСК, выделенных из всех источников,может индуцибельно возрастать при сокультивировании МСК с мононуклеарнойфракцией периферической крови здоровых доноров в присутствии ФГА либо ЛПС, атакже под воздействием провоспалительного цитокина ФНОα (Рис.3). Усилениеэкспрессии HLA потенциально делает МСК более иммуногенными, что может оказыватьвлияние на исход клинического применения аллогенных МСК.МСК костного мозга характеризовались более низкими значениями среднейинтенсивности флуоресценции клеток, экспрессирующих CD90, чем МСК пупочногоканатика и жировой ткани, что свидетельствует о различной плотности изучаемогоантигена на поверхности клеток, полученных из этих источников (Рис.4.).
Ранее былапоказана корреляция между уровнем экспрессия CD90 на поверхности МСК и уровнем ихиммуносупрессорной активности, что, возможно, опосредовано снижением продукциинеклассического антигена HLA-G и цитокина IL-10 (Campioni et al., 2009).костный мозгжировая тканьпупочный канатикРисунок 4. Средняя интенсивность флуоресценции культур МСК, экспрессирующих антигенCD90, полученных из костного мозга, жировой ткани и пупочного канатика. Указаны стандартныеотклонения. * – достоверные различия при р<0,05.Таким образом, МСК из различных источников, имеют в целом, сходныйиммунофенотип, но существуют различия в экспрессии CD10, CD13 и CD90. Это,возможно, влияет на функциональную активность МСК (либо указывает на ее уровень),что в свою очередь, может сказываться на проявлении свойств МСК in vivo.Исследование активности МСК при сокультивировании с лимфоидными клетками.Функциональную активность МСК, выделенных из разных источников, оценивали поих влиянию на эффекторные клетки при контактном сокультивировании в условияхгипоксии.
В качестве эффекторных клеток использовали Т- и В-лимфоциты в составемононуклеарной фракции, либо изолированные В-лимфоциты, а также клетки Влимфоидных клеточных линий Namalva и U266. Клетки мононуклеарной фракциистимулировали ФГА, либо ЛПС, которые являются митогенами для Т- и В-лимфоцитов,соответственно.Изучение влияния МСК на Т-лимфоциты. Согласно существующим в литературеданным, МСК могут влиять на процессы, происходящие на каждом из этапов Тклеточного ответа: при активации Т-клеток, пролиферации и осуществлении эффекторныхфункций.
В ходе данной работы было показано, что МСК из всех источниковстимулируют раннюю активацию Т-лимфоцитов. Внесение ФГА в смешанную культуруаддитивно увеличивало количество Т-лимфоцитов, экспрессирующих СD69 (Рис.5.А.).При более длительном сокультивировании клеток мононуклеарной фракции с ФГА,наоборот, наблюдали подавление ФГА-индуцированного повышения экспрессии позднегомаркера активации (HLA-DR) (Рис.5.Б.).10*#*#*#А****без стимулаФГАHLA-DR+ Т-лимфоциты, %CD69+ Т-лимфоциты, %МНК454035302520151050костный мозгжировая тканьБ20пупочный канатик*1510# # #50без стимулаФГАРисунок 5. А. Содержание CD69+ Т-лимфоцитов относительно общего количества Т-клеток.Б.Содержание HLA-DR+ Т-лимфоцитов относительно общего количества Т-клеток. *-данные,достоверно отличные от контроля (мононуклеарная фракция без стимула), # - данные, достоверноотличные от показателей в мононуклеарной фракции в присутствии ФГА(Р<0,05).АДоля поделившихся клеток, %Таким образом, МСК оказывали противоположное влияние на содержание Тлимфоцитов, несущих ранний и поздний маркеры активации, стимулируя экспрессиюСD69, но подавляя индуцированную ФГА экспрессию HLA-DR.
Поскольку увеличениесодержания Т-лимфоцитов, экспрессирующих СD69, характерно для пациентов сревматоидным артритом (Laffon et al., 1991) и РТПХ, а HLA-DR – с болезнью Крона,атопическим дерматитом и также РТПХ (Funderburg et al., 2012; Morante et al., 2006), дляклинического применения МСК необходимо анализировать характер их влияния наактивацию Т-лимфоцитов пациента.Влияние МСК, полученных из разных источников, на пролиферацию Т-лимфоцитовПодавление пролиферации Т-лимфоцтов в смешанной культуре клетокмононуклеарной фракции или лимфоцитов с МСК ранее было показано во многихработах (Di Nikola et al., 2003; Duffy et al., 2011), и может на данный моментрассматриваться как тестовая система для оценки иммуносупрессорных свойств разныхкультур МСК.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
