Автореферат (Сигнальная регуляция развития симбиоза гороха Pisum sativum L. с клубеньковыми бактериями), страница 3

Статистическая программа One-way ANOVAбыла использована для сравнения уровней экспрессии изучаемых генов в корняхтрансгенных растений гороха.Получениегенетическихконструкций.Амплификациюпоследовательностей PsKNOX3 и PsWOX5 проводили на матрице кДНК с помощьюPhusion Flash полимеразы и соответствующих праймеров. PsKNOX3 и PsWOX5были клонированы в промежуточном векторе pDONR221 с помощью BP клоназы, азатем в векторе pB7WG2D с помощью LR клоназы. Для трансформации растенийполученные конструкции были введены в A. rhizogenes Arqua1.

Для подавленияэкспрессии изучаемых генов были амплифицированы короткие фрагменты генов наматрице кДНК, которые были клонированы в pENTR-D-TOPO векторе, а затем ввекторе pK7GWIWG2D с помощью LR клоназы.Трансформация растений с помощью A. rhizogenes. Для трансформациигороха использовали 5-дневные проростки, которые обрезали в области гипокотиляи трансформировали свежей культурой A. rhizogenes Arqua1. Растения былипомещены в пластиковые сосуды на среду Jensen (van Brussel et al., 1982) икультивированы с A.

rhizogenes в течение 10 - 12 дней при 21 °C, а затемперенесены на среду Emergence (Limpens et al., 2004), содержащую 150 мг/млантибиотика цефотаксима. После 5 - 7 дней инкубации растения переносили ввермикулит и инокулировали Rlv CIAM1026, наличие клубеньков у растений9проверяли на 14 - 21 дпи.Гистохимическое выявление активности β-глюкуронидазы (GUS). GUSактивность в корнях растений была проанализирована при использовании 2 мM 5бромо-4-хлоро-3-индолил-β-d-глюкуроновой кислоты в качестве субстрата (Van denEede et al., 1992).

После окрашивания корни были помещены в фиксатор (3 %параформальдегид, 0,25 % глутаральдегид, 0,1 % Tween-20, 0,1 % Triton X-100 в 1/3MTSB буфера). Срезы корней и клубеньков анализировали под флюоресцентноммикроскопом (Carl Zeiss, Германия).Вестерн-блот-анализ. Белковые образцы разделяли электрофоретически в10% ДСН-ПААГ по методу Laemmli (1970) и переносили на нитроцеллюлозу. Дляинкубации использовали специфичные антитела к GFP, RFP и FLAG (Invitrogen,США). Для визуализации полос преципитации применяли антитела против IgGкролика, конъюгированные с пероксидазой.

Полосы выявляли после реакции с 4хлор-1-нафтолом.РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕЧасть 1. Изучение сигнального обмена между горохом P. sativum L. иклубеньковыми бактериями на начальных этапах развития симбиоза.На основании анализа влияния на растения гороха мутантных штаммов ризобий Rh.leguminosarum bv. viciae nodL, nodFEL-, выделяющих измененные по структуреNod-факторы (Spaink et al., 1991; Van Brussel et al., 1992), была предложена гипотезаоб участии в связывании этих сигнальных молекул двух отличающихся поспецифичности рецепторов, работающих на разных этапах развития симбиоза(Walker and Downie, 2000).

Для получения экспериментальных доказательствданной гипотезы мы предложили найти у гороха молекулярные маркеры,экспрессия которых могла быть связана с активацией разных сигнальных путей присвязывании Nod-факторов.1.1. Поиск молекулярных маркеров, экспрессия которых могла быть связана сактивацией разных сигнальных путей у гороха при рецепции Nod-факторов.Нами была проанализирована зависимость между активацией компонентовсигнального каскада в ответ на рецепцию Nod-факторов и экспрессией симбиозспецифичных генов нодулинов PsEnod5 и PsEnod12a. Кроме того, была изученароль двух выявленных ранее LysM-рецептор-подобных киназ (LysM-РПК) горохаSym10 и Sym37 (Madsen et al., 2003; Zhukov et al., 2008) в активации экспрессиигенов нодулинов.Ранее для пяти генов - PsSym10, PsSym19, PsSym8, PsSym9 и PsSym7,контролирующих ранние этапы передачи сигнала после рецепции Nod-факторов,был определен порядок их вовлечения в сигнальный путь на основе анализаморфологических и физиологических ответов, активируемых Nod-факторами(Walker et al., 2000; Tsyganov et al., 2002).

Мы показали, что транскрипционнаяактивация обоих генов нодулинов зависела от функционирования Sym10, Sym19,Sym8, Sym9 и Sym7 компонентов сигнального пути. Следовательно,консервативный сигнальный «модуль», включающий компоненты от LysM-РПК,кодируемой геном PsSym10, до Ca2+, кальмодулин-зависимой киназы (CCaMK) итранскрипционного фактора (ТФ) NSP2, кодируемыми генами PsSym9 и PsSym7,является необходимым для активации симбиоз-специфичных генов у гороха в ответна рецепцию Nod-факторов (рисунок 1, 2, схема 1).10Рисунок 1. Профили экспрессии генов PsEnod12a, PsEnod5 и убиквитина вкорнях симбиотических мутантов гороха, инокулированных Rlv CIAM 1026.ПЦР продукты были разделены в 1.5% агарозном геле.

Экспрессия убиквитина былаиспользована для стандартизации количеств кДНК между образцами. Продукты ПЦР былигибридизованы с ДНК пробами - 32P-PsENOD5, PsENOD12a и убиквитином послещелочного переноса на мембрану Hybond-N+.Среди двух генов, исследованных нами, ген PsEnod5 регулируется болеестрогим образом: для его активации необходим не только консервативный модульSym10, Sym19, Sym8, Sym9, Sym7 (ТФ NSP2), но также Sym35 (ТФ NIN), Sym14,Sym16 и Sym34 (рисунок 1, 2). Анализ экспрессии PsEnod5 у мутантов указывает нато, что после стадии, контролируемой ССаМК (Sym9), в дальнейшую передачусигнала вовлечены две группы генов, контролирующие развитие инфекции иморфогенез клубеньков у гороха, которые функционируют параллельно (схема 1).Только одна из этих групп генов необходима для активации экспрессии PsEnod5.Наконец, мы показали, что для индукции PsEnod5 необходимфункциональный рецептор Sym37, который, по-видимому, активирует целуюгруппу регуляторных генов, определяющих развитие более поздних этаповсимбиоза - инфекции и органогенеза клубеньков (рисунок 2).Рисунок 2.

Экспрессия генов PsEnod12a, PsEnod5 и убиквитина у мутантныхлиний гороха K24 (sym37) и P56 (sym10), инокулированных Rlv CIAM 1026.Таким образом, активация нескольких сигнальных путей, маркерами которыхявляются нодулины PsEnod12a и PsEnod5, иразная роль LysM-РПК Sym10 и Sym37 виндукции этих путей, свидетельствуют впользу предположения о том, что узнаваниеNod-факторовугорохаможетконтролироваться различными рецепторами.Схема 1. Порядок вовлечения в передачусигнала компонентов пути, активируемогоNod-факторами у гороха P.

sativum (Dolgikhet al., 2011). Sym10 - LysM-РПК, Sym19 - РПК cлейциновыми повторами, Sym8 - K+ канал, Sym9 CCaMK, Sym7 - ТФ NSP2, Sym35 - ТФ NIN.111.3. Выявление новых кандидатов на роль рецепторов к Nod-факторам угороха и оценка их способности контролировать развитие симбиоза.(Результаты исследований, представленные в разделах 1.3 и 1.4, были получены совместнос аспиранткой ФГБНУ ВНИИСХМ Кириенко Анной Николаевной, руководствокандидатской диссертацией которой осуществлено автором настоящего диссертационногоисследования).Фенотипический анализ мутантов sym10 и sym37 показал, что кодируемые этимигенами LysM-РПК могут работать на разных этапах развития симбиоза (Madsen etal., 2003; Zhukov et al., 2008).

У Sym10, необходимой для инициации симбиоза,киназный домен является неактивным («мертвая» киназа), что указывает навозможность формирования комплекса с другой рецепторной киназой, которая донастоящего времени еще не выявлена. В связи с этим на следующем этапеисследований перед нами стояла задача выявить дополнительные рецепторы к Nodфакторам у гороха, а также выяснить, как они могут функционировать присвязывании Nod-фактора.Других мутантов, кроме sym10 и sym37, у гороха выявлено не было.

Однакоскрининг библиотеки кДНК клубеньков гороха позволил выделить ген PsK1,который показал высокую степень гомологии с геном PsSym37 (Zhukov et al., 2008).В пользу предположения о том, что K1 может быть дополнительным рецептором кNod-факторам у гороха, свидетельствуют данные о строении киназного домена уэтого белка, в котором присутствует характерная для симбиотических рецепторовпоследовательность YAQ (Nakagawa et al., 2011).

Следующая часть нашей работыбыла посвящена проверке данной гипотезы.Удобным подходом для выяснения функции рецептора может бытькомпьютерное моделирование его связывания с лигандом. В связи с этим намибыла построена модель взаимодействия LysM-РПК К1 с основным Nod-фактором,выделяемым бактериями Rlv NodRlv-V, C18:4, Ac. Математическое моделированиесвязывания внеклеточного домена LysM-РПК K1 гороха с NodRlv-V, C18:4, Acпоказало возможность укладывания остова Nod-фактора в междоменную бороздумежду LysM1 и LysM3 внеклеточного домена К1 (рисунок 3). При этомсущественную роль в связывании Nod-фактора могут играть аминокислотныеостатки в LysM3-мотиве во внеклеточном домене. Следовательно, на основаниипроведенного анализа можно сделать вывод о том, что К1 является потенциальнымрецептором к Nod-факторам у гороха.Рисунок 3.

Математическое моделирование связывания внеклеточного доменарецептора К1 с NodRlv-V, Ac, C18:4. Модель внеклеточного домена LysM-РПК К1была построена с использованием в качестве шаблона LysM-РПК CERK1 A. thaliana.Для проверки связывающей способности LysM-РПК К1 с Nod-факторамибыл осуществлен синтез внеклеточного домена этого рецептора в бактериях E. coli12по ранее разработанной схеме. Очистку внеклеточного домена K1-ECD проводили спомощью металлохелатной аффинной хроматографии. Анализ связывающейспособности K1-ECD с Nod-факторами с помощью метода поверхностногоплазмонного резонанса позволил выявить Kd = 1,29 х 10-8 ± 0,51.Наконец, для доказательства участия LysM-РПК К1 в контроле развитиясимбиоза из коллекции TILLING мутантов были изолированы два мутанта по генуk1.