Автореферат (Идентификация и анализ взаимодействия прионов и амилоидов в протеоме дрожжей saccharomyces cerevisiae), страница 3

Эти данные позволилипредположить, что фактор [NSI+] имеет прионную природу. GuHCl -зависимаяэлиминация дрожжевых прионов связана с тем, что это вещество ингибируетАТФ-азную активность шаперона Hsp104 [Ferreira et al., 2001], которыйнеобходим для расщепления (т.е. размножения) прионных агрегатов. Мыоценили влияние делеции HSP104 на поддержание фактора [NSI+].

Все клоны10штамма 3-1-1-D931 (дериват 1-1-D931 [NSI+]) с делецией HSP104) утратилисупрессорный фенотип (рис. 5).Рисунок 5. Влияние делеции гена HSP104 наподдержание и проявление фактора [NSI+].Дрожжевые прионные факторы обладают общими характеристиками:могут возникать de novo после элиминации; наследуются как нехромосомныедоминантные факторы; демонстрируют инфекционность (передаютсяцитодукцией и в результате белковой трансформации). Мы проверилисоответствие фактора [NSI+] всем характеристикам дрожжевых прионов.Спонтанное возникновение отдельных клонов, демонстрирующихфенотип [NSI+] (рост на среде без аденина, который элиминируетсяпассированием клеток на среде с GuHCl), было отмечено с частотой 5 x 10-6[Saifitdinova et al., 2010].

Для анализа характера наследования фактора [NSI+]штамм 1-1-D931[NSI+] a-типа спаривания, содержащий плазмиду pU-AβSup35MC, скрещивали с изогенным ему штаммом 2-1-1-1-D931 [nsi-] α-типаспаривания, содержащим плазмиду pL-Aβ-Sup35MC.

Диплоидов отбирали насреде –Leu-Ura. Диплоидный статус отдельных клонов проверяли контрольнымскрещиванием с тестерами типа спаривания. Все отобранные диплоидыдемонстрировалинонсенс-супрессорныйфенотип,изгоняемыйпритрѐхкратном пассировании клеток на среде с 5mM GuHCl. Таким образом,[NSI+] демонстрирует доминантное проявление [Цапонина и др.

2005;Saifitdinova et al., 2010]. При споруляции диплоидных клонов в тетрадахвыявлялось лишь от одной до трѐх жизнеспособных аскоспор. В связи с этимнаследование фактора [NSI+] анализировали с помощью случайной выборкиаскоспор. В потомстве всех проанализированных диплоидных клоновподавляющеебольшинствогаплоидныхсегрегантов(237клонов)+демонстрировали супрессорный фенотип (Ade ) и лишь 9 клонов не росли насреде без аденина. Клоны утрачивали способность к росту на среде без аденинапосле пассирования на среде с GuHCl. Расщепление по типу спариваниястатистически достоверно не отличалось от 1:1 (χ2 < 3,84).Для оценки инфекционных свойств [NSI+] был использован методбелковой трансформации. Штамм [nsi-] трансформировали вектором pRS315 ибелковым экстрактом из штамма [NSI+].

Вектор pRS315 [Christianson et al.,1992] использовали для повышения эффективности отбора сферопластов,компетентных к трансформации. Трансформантов отбирали на селективнойсреде и проверяли тип спаривания. В трѐх независимых экспериментах клоны,демонстрирующие супрессию, которая элиминируется на среде с GuHCl,выявлялись с частотами от 5 до 7%. В контрольном эксперименте, где белковыйэкстракт был выделен из штамма [nsi-], трансформанты, демонстрирующие11нонсенс-супрессию не выявлялись [Saifitdinova et al., 2010]. [NSI+] передаѐтсятакже реципиентным клеткам при цитодукции, что подтверждаетинфекционные свойства этого фактора [Цапонина и др., 2005].На основании полученных результатов можно заключить, что фактор+[NSI ] обладает всеми характеристиками дрожжевого приона – возникает denovo после элиминации, демонстрирует доминантное нехромосомноенаследование и обладает инфекционностью.Выявление генов, изменение уровня экспрессии которых влияет нафенотипическое проявление [NSI+]Для выявления генов, изменение уровня экспрессии которых влияет нафенотипическое проявление [NSI+], мы оценили эффект сверхэкспрессии всехдрожжевых генов в штамме 1-1-D931 [NSI+], используя геномную библиотекуYSC4613 “Open Biosystems”.

В результате скрининга было установлено, чтосупрессорный фенотип, характерный для штаммов [NSI+], маскируется врезультате сверхэкспрессии гена SUP45 (рис. 6 А).Рисунок 6. Фактор [NSI+] снижает уровеньэкспрессии гена SUP45. А – Трансформацияштамма [NSI+] многокопийной плазмидой скопией гена SUP45 вызывает маскировкусупрессорного фенотипа, но после потериплазмиды фенотип восстанавливается. Б –Относительное количество мРНК SUP45 вштаммах 1-1-D931 [NSI+] и 1-1-1-D931 [nsi-].

В –Сравнительныйанализотносительногоколичества белка Sup45 в штаммах [NSI+] и [nsi-],находящихсявэкспоненциальнойистационарной фазе роста.Более того, подавление супрессорного фенотипа вызывает даже введение копииSUP45 под контролем собственного промотора в составе центромернойплазмиды pRS315-SUP45. Мы сравнили относительные количества мРНКSUP45 в штаммах 1-1-D931 [NSI+] и 1-1-1-D931 [nsi-] при помощи ПЦРРВ.Данные анализа четырнадцати независимо полученных проб мРНК каждого изштаммов, воспроизведѐнные в трѐх повторностях, показали, что в штамме[NSI+] достоверно (p≤0,01) снижено количество мРНК SUP45 в сравнении соштаммом [nsi-] (значения параметров Сt составляют 2,08±0,521 и 1,00±0,289для [NSI+] и [nsi-] штаммов, соответственно) (рис. 6Б).

Наблюдаемая разницасоответствует снижению количества мРНК SUP45 в штамме [NSI+]12приблизительно в два раза (2-Ct=2,14), что полностью объясняетантисупрессорный эффект введения SUP45 на центромерной плазмиде.Результаты количественной оценки данных Вестерн-блот гибридизациипоказали, что относительное количество белка Sup45 в штаммах [NSI+]статистически достоверно (p=0,009) снижено в сравнении со штаммами [nsi-] вклетках, находящихся в стационарной, но не в экспоненциальной фазе роста(рис. 6В).

Таким образом, возникновение детерминанта [NSI+] вызываетснижение содержания мРНК SUP45 в клетке, что закономерно приводит куменьшению количества белка Sup45 в стационарной фазе роста и к нонсенссупрессии [Кондрашкина и др.2014].Идентификация инфекционных и неинфекционных амилоидов в дрожжахS. cerevisiae методом «протеомного скрининга амилоидов»В результате сверхэкспрессии всех дрожжевых генов в штамме [nsi-] намне удалось выявить ген-детерминант фактора [NSI+]. Для решенияпоставленных в работе задач мы разработали протеомный методидентификации амилоидов, основанный на знании их универсальныхбиохимических свойств.

При разработке метода протеомного скрининга иидентификации амилоидов, названного нами PSIA (Proteomic Screening forIdentification of Amyloids) мы основывались на предложенном ранее подходе повыделению высокомолекулярной фракции детергент-устойчивых белковыхагрегатов, обогащѐнной амилоидами [Kushnirov et al., 2006]. Для выявления иидентификации в этой фракции любых, даже минорных белков, формирующихамилоидные агрегаты, мы разработали схему экспериментов, объединяющуюнесколько биохимических и протеомных методов, и апробировали еѐ напримере выявления уже известных дрожжевых прионов [PIN+] и [PSI+].Методика включает три основных этапа: 1) выделение и очистка припомощи серии ультрацентрифугирований белковых агрегатов, устойчивых кобработке ионными детергентами; 2) разделение фракции белков,формирующих детергент-устойчивые агрегаты, с помощью двумерногоэлектрофореза белков, окрашенных флуорохромами; 3) выделение окрашенныхбелков из геля, трипсинолиз и идентификация с помощью масс-спектрометрии.Выделение белков, формирующих детергент-устойчивые агрегаты, вклетках штамма GT81-1C [PSI+][PIN+] и его изогенного деривата GT409[psi-][pin-] было проведено как описано в нашей статье [Nizhnikov et al., 2014].Детергент-устойчивую фракцию белковых агрегатов растворяли в буфере,содержащем мочевину и тиомочевину, а нерастворимые в буфере белковыеагрегаты отделяли центрифугированием.

Растворимые в буфере белки изштамма [PSI+][PIN+] окрашивали красным флуорохромом Cy5, а из штамма[psi-][pin-] зелѐным флуорохромом Cy3. На следующем этапе белки,13выделенные из обоих штаммов, смешивали и разделяли методом двумерногогель-электрофореза. На рис. 7А и 7Б представлены результаты выделениябелковых агрегатов, устойчивых к обработке 1% SDS и 3% саркозинатомнатрия, соответственно. Необходимость использования саркозината связана стем, что некоторые амилоиды неустойчивы к обработке SDS, но нерастворяются при использовании более мягких детергентов [Urakov et al., 2010;Coalier et al., 2013]. Белкам, представленным в обоих штаммах, соответствуютжѐлто-зелѐные сигналы, тогда как белки, образующие агрегаты исключительнов штамме [PSI+][PIN+], окрашены красным цветом.

Красные пятна, как в случаеобработки SDS, так и при обработке саркозинатом, были идентифицированы спомощью масс-спектрометрии как белок Rnq1 – детерминант приона [PIN+](данные спектрометрии представлены в таблице 2). В обоих случаях белкуRnq1соответствовалинесколькосигналов,различающихсяпоизоэлектрической точке, но не по массе. Это может быть связано спосттрансляционными модификациями белка Rnq1. Белкам, формирующимагрегаты, устойчивые к 1% SDS как в штамме [PSI+][PIN+], так и в штамме [psi][pin-], соответствовали жѐлтые сигналы, образующиеся в результатеналожения флуорохромов Cy3 и Cy5.

Этим сигналам соответствовали белкиGas1, Ape1 и Ape4 (рис. 7 А; таблица 2). Белки Gas1, Ape1 и Ape4 быливыявлены также при обработке фракции белковых агрегатов 3% саркозинатомнатрия (рис. 7Б). Эти белки либо образуют конститутивные амилоидныеполимеры в дрожжах, либо формируют детергент-устойчивые агрегатынеамилоидной природы. В результате обработки белковых агрегатовсаркозинатом, который является более мягким детергентом в сравнении с SDS,на геле выявляется гораздо больше жѐлтых сигналов, которым соответствуютбелки, образующие агрегаты в штаммах [PSI+][PIN+] и [psi-][pin-] (рис. 7А и 7Б).Важно отметить, что наличие относительно большого количества белков немешает выявлению прионов, поскольку использование разноцветныхфлуорохромов позволяет чѐтко выявлять белки, формирующие агрегатыисключительно в прионсодержащем штамме.Отметим, что белок Sup35, образующий прионные агрегаты в штамме+[PSI ][PIN+], не выявлен с помощью двумерных электрофорезов (рис.

7 А и 7Б).Мы показали, что Sup35 выявляется в штамме [PSI+][PIN+], во фракциибелковых агрегатов, нерастворимых в буфере, содержащем мочевину итиомочевину. Белки из этой фракции, выделенные из опытного и контрольногоштаммов, были денатурированы кипячением в 2% SDS, разделены с помощьюодномерного гель-электрофореза и визуализированы окрашиванием кумассиR250.

Полоска, представленная исключительно в штамме [PSI+][PIN+] (рис.7В),была идентифицирована масс-спектрометрией как белок Sup35 (таблица 3).14Рисунок 7. Белки, формирующие детергентустойчивые агрегаты в штаммах GT81-1C [PSI+][PIN+]и GT409 [psi-][pin-]. А - Изображение двумерногоэлектрофореза белков, образующих SDS-устойчивыеагрегаты. Белки из штаммов GT81-1C [PSI+][PIN+] иGT409[psi-][pin-]окрашеныфлуорохромамиCy5(красный) и Cy3(зелѐный), соответственно.