Автореферат (Идентификация и анализ взаимодействия прионов и амилоидов в протеоме дрожжей saccharomyces cerevisiae)

На правах рукописиГАЛКИН АЛЕКСЕЙ ПЕТРОВИЧИдентификация и анализ взаимодействия прионов и амилоидов впротеоме дрожжей Saccharomyces cerevisiaeспециальность: 03.02.07 – генетикаАВТОРЕФЕРАТдиссертации на соискание ученой степенидоктора биологических наукСанкт-Петербург2016Работа выполнена на кафедре генетики и биотехнологии биологическогофакультета Федерального государственного бюджетного образовательногоучреждения высшего образования «Санкт-Петербургский государственныйуниверситет»Научный консультант: доктор биологических наук, академик РАН Инге-ВечтомовСергей ГеоргиевичОфициальные оппоненты:Сойдла Тыну Рихович, доктор биологических наук, ведущий научный сотрудник,руководитель группы генетики митоза при лаборатории структурной динамики,стабильности и фолдинга белков Федерального государственного бюджетногоучреждения науки Институт цитологии Российской Академии наук (ИНЦ РАН)(Санкт-Петербург);Шавловский Михаил Михайлович, доктор медицинских наук, профессор,заведующий лабораторией Молекулярной генетики человека Федеральногогосударственного бюджетного научного учреждения "Институтэкспериментальной медицины" (Санкт-Петербург);Саранцева Светлана Владимировна, доктор биологических наук, заместительдиректора по научной работе Федерального государственного бюджетногоучреждения "Петербургский институт ядерной физики им.

Б.П. Константинова"НИЦ "Курчатовский институт" (Гатчина).Ведущая организация: федеральное государственное бюджетное учреждение«Научно-исследовательский институт гриппа» Министерства здравоохраненияРоссийской Федерации (Санкт-Петербург).Защита диссертации состоится ________________ 2016 г. в _______ часовна заседании совета Д.212.232.12 по защите докторских и кандидатскихдиссертаций при Санкт-Петербургском государственном университете по адресу:199034 Санкт-Петербург, Университетская наб.

7/9, СПбГУ, биологическийфакультет, кафедра генетики и биотехнологии, аудитория 1.С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке им. М. ГорькогоСанкт-Петербургского государственного университета и на сайте СанктПетербургского государственного университета (http://spbu.ru/ science/disser/).Автореферат разослан_______________________ 201_ г.Ученый секретарь диссертационного совета Д.212.232.12доктор биологических наукЛюдмила Андреевна МамонОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫАктуальность темы исследования. Амилоиды представляют собой белковыеполимеры, которые формируются за счѐт образования упорядоченныхмежмолекулярных бета-складчатых слоѐв [по: Baxa, 2008].

Инфекционныеамилоидные полимеры (прионы), в отличие от неинфекционных, расщепляютсяна олигомеры, которые в свою очередь способны присоединять иконвертировать новые мономеры белка в амилоидную изоформу [по: Галкин идр., 2006]. Прионы и неинфекционные амилоиды выявлены у самых разныхорганизмов и, зачастую, их формирование вызывает цитотоксический эффект.Согласно медицинской классификации болезни, связанные с образованиеммежклеточных амилоидных агрегатов, принято называть «амилоидозами»,тогда как патологии, которые определяются накоплением внутриклеточныхамилоидов, относят к «амилоидозоподобным» заболеваниям [Sipe et al., 2014].К числу наиболее социально значимых амилоидных заболеваний относятсяболезни Альцгеймера и Паркинсона, а также прионные болезни. В настоящеевремя известно более 30 различных амилоидных заболеваний человека[Eisenberg and Jucker, 2012].

У дрожжей S. cerevisiae охарактеризовано восемьбелков, которые могут формировать прионные агрегаты и вызыватьнаследуемые эпигенетические изменения, которые стабильно наследуются вряду поколений [Нижников и др., 2015]. Открытие инфекционных амилоидов(прионов) у одноклеточных организмов привело к созданию концепции«белковой наследственности» [Wickner, 1994]. Согласно этой концепции, вслучае прионизации белок инактивируется или изменяет свои функции, чтовызывает наследуемое изменение признака без каких бы то ни было измененийв геноме [Wickner, 1994].

Некоторые амилоиды могут выполнять жизненноважные функции, в частности амилоидные конформеры CPEB и Orb2регулируют долговременную память у Aplysia californica и Drosophilamelanogaster, соответственно [Si et al., 2010; Majumdar et al., 2012]. Из-заотсутствия универсальных биохимических методов поиска амилоидов,имеющиеся данные носят разрозненный характер и не позволяют оценитьраспространѐнность и значимость амилоидов в живой природе. Наша работапосвящена решению таких актуальных задач, как идентификация амилоидов вмасштабах протеома и анализ их взаимодействия in vivo.Степень разработанности темы. Идентификация каждого нового приона илинеинфекционного амилоида крайне трудоѐмка и является заметным научнымсобытием. У млекопитающих новые амилоиды выявляются либо в результатеисследования биохимических свойств отдельных белков, либо вследствиеанализа состава патологических белковых депозитов [Glenner et al., 1984;McKinley et al., 1983].

Дрожжевые прионные белки обычно выявляют врезультате генетического скрининга факторов, стабильно передающихся в рядупоколений и демонстрирующих неменделевское наследование. С помощью3генетических подходов можно выявлять лишь те белки, амилоидогенезкоторых вызывает видимые фенотипические изменения. Такой подход неявляется системным и не может дать полного представления ораспространѐнности и значимости амилоидов в регуляции физиологических ипатологических процессов. Прогресс в данном направлении исследованийможет обеспечить разработка универсального биохимического методаскрининга и идентификации амилоидов в протеоме различных организмов.Исследование взаимодействия амилоидов представляет особый интерес сбиомедицинской точки зрения.

Показано, что возникновение одних амилоидовзачастую индуцирует агрегацию других амилоидогенных белков [Derkatch etal., 2001] и провоцирует глобальные изменения в регуляции протеомныхвзаимодействий [Nevzglyadova et al., 2009]. Изучение взаимодействияамилоидогенных белков в экспериментах на трансгенных животных сопряженос методическими сложностями, занимает много времени и требует большихматериальных затрат. Наибольший прогресс в исследованиях взаимодействийприонов и неинфекционных амилоидов in vivo достигнут при использованиидрожжевой модельной системы [Inge-Vechtomov, 2011].Цель и задачи работыЦелью работы является идентификация прионов и неинфекционных амилоидовв протеоме дрожжей, а также анализ взаимодействия амилоидогенных белковмлекопитающих in vivo в дрожжевой модельной системе.Задачи:1.

Выявление и характеристика новых наследуемых изменений признаков,опосредованных прионизацией белков дрожжей S. cerevisiae.2. Идентификация белков, прионизация которых вызывает наследуемыеизменения признаков.3. Разработка универсального метода протеомного скрининга амилоидов и егоиспользование для идентификации белков, образующих агрегаты,обладающие амилоидными свойствами.4. Проверка адекватности дрожжевой модели для анализа взаимодействиябелков млекопитающих, формирующих амилоидные агрегаты.Научная новизна. Впервые показано, что взаимодействие прионов [PIN+] и[SWI+] вызывает наследуемое изменение признака.

Предложена гипотеза,объясняющая механизм прионных взаимодействий. Показано, что белки Rnq1 иSwi1 в прионной форме приобретают новую, ранее не охарактеризованнуюфункциональную активность. Выявлен список белков, которые демонстрируютамилоидные свойства in vivo и являются кандидатами на роль функциональныхамилоидов дрожжей S. cerevisiae. Разработана и успешно апробирована новаяметодология, позволяющая выявлять и идентифицировать прионы инеинфекционные амилоиды различных организмов. В дрожжевой модельнойсистеме выявлены аминокислотные последовательности прионного белка4млекопитающих, ответственные за взаимодействие патогенных агрегатов этогобелка с амилоидным пептидом бета (Aβ), агрегация которого связана сболезнью Альцгеймера.Теоретическая и практическая значимость работы.

Полученные в работерезультаты дополняют теорию белковой наследственности. Предложенаконцепция, согласно которой функциональные взаимодействия прионов,опосредованные другими компонентами протеомной сети, вызываютнаследуемые изменения признаков. Показано, что эффекты функциональноговзаимодействия прионов могут быть описаны в рамках традиционнойклассификации генных взаимодействий. Теоретическая значимость работыопределяется также выявлением в протеоме дрожжей S. cerevisiae ряда белков,являющихся потенциальными кандидатами на роль функциональныхамилоидов.

Практическая значимость работы определяется тем, чторазработанная методология протеомного скрининга амилоидов открываетширокие перспективы для выявления функциональных и патологическихамилоидов у различных биологических объектов и позволяет оценитьраспространѐнность и значимость явлений прионогенеза и амилоидогенеза вживой природе. В частности, разработанный нами подход может бытьиспользован для выявления ещѐ не охарактеризованных амилоидов,вызывающих заболевания человека, этиология которых пока неизвестна.Положения, выносимые на защиту1.

Дополнена теория белковой наследственности – установлено, чтовзаимодействие прионов может вызывать наследуемые изменения признаков.2. Белки Rnq1 и Swi1 в результате прионизации приобретают новуюфункциональную активность.3. С помощью новой методологии в протеоме S. cerevisiae идентифицированыбелки, демонстрирующие амилоидные свойства и являющиеся кандидатамина роль функциональных амилоидов.4. Показана адекватность использования дрожжевой модели для исследованияагрегации и взаимодействия гетерологичных амилоидов.Степень достоверности и апробация результатов. Полученные результатыдостоверны и были представлены в виде устных докладов на следующихроссийских и международных конференциях: «Нобелевские чтения» 2003,Санкт-Петербург; XXI th YGM Conference, 2003, Гетеборг, Швеция; 2-я конф.МОГиС, 2003, Москва; “Prion 2006”, Турин, Италия; V съезд ВОГиС, 2009,Москва; «Нейронаука для медицины и психологии», 2012, Судак, Украина;FEBS Congress, 2013, Санкт-Петербург; VI Съезд ВОГиС, 2014, Ростов-наДону.

Результаты представлены также на заседании президиума СанктПетербургского научного центра РАН в 2011 г, на заседании по программеПрезидиума РАН «Фундаментальные науки – медицине», 2010, Москва, вприглашѐнном докладе в Georgia institute of Technology, США, 2008 и на5научных семинарах кафедры генетики и биотехнологии СПбГУ. Результатыопубликованы в 13 статьях в международных и отечественных журналах изперечня ВАК, ряде тезисов конференций и включены в главу монографии.Оформлен патент на изобретение РФ №- 2294964.Личный вклад автора.