Автореферат (1144699), страница 5
Текст из файла (страница 5)
Вместе с тем, слабый супрессорныйфенотип стабильно наследуется и элиминируется при пассировании на среде сGuHCl (рис. 9). Делеция гена RNQ1 не оказывает влияния на рост дрожжей насредах с неферментатируемыми источниками углерода (не представлено).
Наосновании полученных результатов можно заключить, что проявление фактора[NSI+] определяется как минимум двумя прионами - [PIN+] и ещѐ однимприоном, который элиминируется GuHCl.Рисунок 9. Влияние приона[PIN+]напроявление+фактора [NSI ].Наиболее вероятным кандидатом на роль второго детерминанта фактора[NSI ] является белок Swi1. Для проверки влияния приона [SWI+] наподдержание и проявление фактора [NSI+] необходимо делетировать ген SWI1,а затем вновь ввести этот ген в исследуемый штамм. Такой подход приводит кэлиминации приона и позволяет оценить его возможные эффекты. Делеция генаSWI1 привела к усилению супрессорного фенотипа и вызывала задержку ростана средах с галактозой и глицерином (рис. 10). Последующее введениеплазмиды p426GPD–SWI1YFP вызывает полную элиминацию всех проявленийфактора [NSI+] – трансформанты, так же как клетки штамма [nsi-] не растут насредах без аденина и триптофана и не демонстрируют дефектов роста на средес галактозой (рис.
10). Таким образом, временная инактивация гена SWI1вызывает элиминацию всех проявлений прионного фактора [NSI+]. Вместе стем, супрессорный фенотип, характерный для штаммов [NSI+], наблюдаетсялишь при наличии двух прионов [SWI+] и [PIN+] (см. рисунки 9 и 10).+Рисунок 10. Влияние приона[SWI+] на проявление фактора[NSI+]. Делеция гена SWI1 ипоследующаятрансформацияисследуемогоштаммаплазмидой p426GPD-SWI1YFPприводят к элиминации всехпроявлений фактора [NSI+].На основании полученных данных можно заключить, что наблюдаемыенаследуемые изменения признаков определяются не неизвестным прионнымфактором [NSI+], а зависят от взаимодействия двух прионов [SWI+] и [PIN+]. Мы20впервые показали, что взаимодействие прионов, подобно взаимодействиюклассических генов, вызывает наследуемые изменения признаков.Анализ взаимодействия прионов [SWI+] и [PIN+]Для исследования взаимодействия прионов [SWI+] и [PIN+] мы оценили вкладкаждого приона в регуляцию супрессорного фенотипа.
Штаммы [swi-][PIN+] и[SWI+][pin-] были получены из исходного штамма [SWI+][PIN+] 1-1-D931 за счѐтделеции хромосомных копий генов SWI1 или RNQ1, соответственно, ипоследующей трансформации штаммов плазмидами, кодирующими данныегены. Был проведѐн сравнительный анализ проявления нонсенс-мутаций ade114 (UGA) и trp1-289 (UAG) в клетках штаммов [SWI+][PIN+], [swi-][PIN+],[SWI+][pin-], [swi-][pin-] а также swi1Δ[PIN+] (рис.11). В случае анализасупрессии trp1-289 (UAG) какого-либо взаимодействия прионов отмечено небыло – рост на среде без триптофана зависит исключительно от приона [SWI+](рисунок 11).
Интересно отметить, что в случае прионизации Swi1 уровеньсупрессии trp1-289 (UAG) заметно выше, чем в штамме с делецией гена SWI1(рисунок 11).При анализа роста исследуемых штаммов на среде без аденина отмечаетсявзаимодействие прионных детерминантов. Слабая супрессия проявлениянонсенс-мутации ade1-14 (UGA) отмечается в штамме [pin-] [SWI+] (рис. 11).Рисунок 11.
Анализвлияниявзаимодействийприонов [SWI+] и[PIN+] напроявления нонсенсмутаций ade1-14(UGA) и trp1-289(UAG)Сильный супрессорный фенотип характерен для штамма [SWI+][PIN+].Делеция гена SWI1 вызывает ещѐ большее усиление супресии мутации ade1-14,чем наличие в штамме прионов [SWI+] и [PIN+]. С точки зрения формальнойгенетической логики прослеживается следующая схема:1.
прионная инактивация белка Swi1 в штаммах [SWI+][pin-] вызывает слабуюсупрессию проявления нонсенс-мутации ade1-14 (UGA);2. на фоне прионизации белка Rnq1 в штаммах [SWI+][PIN+] инактивация Swi1усиливается, что закономерно приводит к усилению супрессии;3. отсутствие белка Swi1 в штаммах swi1Δ приводит к ещѐ большей супресиипроявления исследуемой нонсенс-мутации.Описаннаясхемаполностьюсоответствуетклассическомутипукомплементарных взаимодействий – один наследственный детерминант21дополняет влияние другого на проявление признака.
Есть только одно отличие– в нашем случае имеет место не взаимодействие классических генов, авзаимодействие прионов. Такой феномен описан впервые.Для проверки гипотезы о влиянии приона [PIN+] на прионные агрегатыбелка Swi1 был проведѐн сравнительный анализ агрегации белка Swi1-YFP вштаммах 1-1-D931 [SWI+][PIN+]), 6-1-4-1-1-D931 [SWI+][pin-], 7-1-4-1-1-D931[swi-][PIN+] и 1-4-1-1 [swi-][ [pin-] (рис. 12). Наибольший процент клеток сагрегатами Swi1-YFP отмечен в штамме 6-1-4-1-1-D931 [SWI+][pin-] (примерно8%). Важно отметить, что в штамме 1-1-D931 [SWI+][PIN+], который в отличиеот штамма 6-1-4-1-1-D931 содержит прион [PIN+], процент клеток с агрегатамиSwi1-YFP в два раза ниже (3,5%). С помощью критерия Манна-Уитни мыпоказали, что различия статистически значимы (p=0,01).Рисунок 12.
Агрегация белка Swi1-YFP в штаммах 4-1-1-D931 [SWI+][PIN+]; 61-4-1-1-D931 [SWI+][pin-], 7-1-4-1-1-D931 [swi-][PIN+] и 1-4-1-1-D931[swi-][ [pin-]Наличие редких агрегатов Swi1-YFP в штаммах 7-1-4-1-1-D931 [swi][PIN+] и 1-4-1-1-D931 [swi-][pin-] связано с тем, что данный белок на фонесверхпродукции спонтанно агрегирует в небольшой доле клеток в штаммах[swi-] [Cow et al., 2011]. Различия в уровне нонсенс-супрессии и в частотахагрегации белка Swi1-YFP, которые демонстрируют штаммы [PIN+][SWI+] и[pin-][SWI+], свидетельствуют о том, что прион [PIN+] прямо или опосредованновлияет на прионные агрегаты белка Swi1. Полученные результаты показываюттакже, что прионизация Rnq1 и Swi1 приводит к появлению новойфункциональной активности этих белков. Прионизация белка Rnq1 влияет наагрегацию Swi1 и усиливает эффект прионных агрегатов [SWI+] на супрессиюпроявления нонсенс-мутации ade1-14 (UGA).
Прионизация Swi1 вызываетсупрессию проявления нонсенс-мутации trp1-289 (UAG), тогда как инактивацияэтого белка в результате делеции гена SWI1 такого эффекта не вызывает.Для проверки гипотезы, согласно которой имеет место физическоевзаимодействиеприонов[PIN+]и[SWI+],штамм[PIN+][SWI+]трансформировали плазмидами pCUP1-RNQ1-CFP(LEU2) и p426GPD–22SWI1YFP, кодирующими гибридные белки Swi1-YFP и Rnq1-CFP. Клетки, вкоторых одновременно присутствовали сигналы, соответствующие белкамRnq1-CFP и Swi1-YFP, выявлялись с очень низкой частотой. Известно, чтосверхпродукция Rnq1 токсична и, по всей вероятности, одновременнаясверхпродукция Rnq1-CFP и Swi1-YFP усиливает токсический эффект.
Ни водной из нескольких тысяч проанализированных клеток колокализацииагрегатов Rnq1-CFP и Swi1-YFP отмечено не было (рис. 13).Рисунок 13. Агрегаты химерных белков Rnq1-CFP иSwi1-YFP не колокализуются в клетках штамма[PIN+][SWI+].Из нашихданных следует, что [PIN+] оказывает не прямое, аопосредованное влияние на прионные агрегаты белка Swi1. Как мы показали(см. рис. 4), супрессия, наблюдаемая в штаммах [SWI+][PIN+] (ранееобозначенных как [NSI+]), связана со снижением эффективности терминациитрансляции.
Снижение эффективности терминации трансляции опосредованоуменьшением уровня экспрессии гена SUP45 (рис. 6). Поскольку белок Swi1является транскрипционным регулятором более чем 6% дрожжевых генов[Peterson and Herskowitz, 1992; Burns and Peterson, 1997], эффект его прионнойинактивации на уровень экспрессии гена SUP45 и терминацию трансляциивполне объясним, однако остаѐтся загадкой, каким образом на этот процессвлияет прион [PIN+]. Наши данные свидетельствуют о том, что прионныеагрегаты белков Swi1 и Rnq1 физически не взаимодействуют. Из этого следует,что белок Rnq1 в прионной конформации приобретает новую функцию иопосредовано влияет на свойства прионных агрегатов [SWI+].
Недавно былопоказано,чтоRnq1тольковприоннойизоформевызываетгиперфосфорилирование белка Pin4 [Yang et al., 2014]. Вполне вероятно, чтоприонные агрегаты Rnq1 секвестрируют репрессор киназы, котораяответственна за гиперфосфорилирование не только Pin4, но и некоторых другихбелков, и в частности Swi1. В связи с этим, интересно отметить, что у белкаSwi1 выявлено необычно много (двенадцать) потенциальных сайтовфосфорилирования (http://www.yeastgenome.org).Полученные данные позволяют сформулировать концепцию, согласнокоторой функциональные взаимодействия прионов, опосредованные другимикомпонентами протеомной сети, могут вызывать наследуемые измененияпризнаков. По аналогии с признаками, наследование которых контролируетсяодним или несколькими генами, можно утверждать, что существуют признаки,проявление которых контролируется прионизацией одного белка, иливзаимодействием различных прионов. Когда мы говорим о взаимодействии23генов, то на самом деле речь идѐт о взаимодействии генных продуктов.
Исходяиз этого, становится понятным, почему взаимодействие прионов приводит ктаким же последствиям, как взаимодействие классических генов. Мы показали,что прионы [SWI+] и [PIN+] демонстрируют комплементарное взаимодействиепо отношению к признаку «супрессия нонсенс-мутации ade1-14(UGA)».Теоретически можно предсказать, что прионы могут взаимодействовать такжепо типу эпистаза и различных вариантов полимерии.Оценка универсальности метода PSIA – выявление амилоидных агрегатовбелков млекопитающих в клетках дрожжейМы предположили, что разработанный нами метод может служитьуниверсальным инструментом для выявления различных амилоидов у любыхорганизмов.
Для проверки этого предположения мы оценили возможностьвыявления агрегатов PrP и Aβ млекопитающих с помощью метода PSIA припродукции этих белков в дрожжах S. cerevisiae. Штамм BY4742 [PIN+]трансформировали плазмидами PGPD-PrP90-231-GFP(URA3) и PGPD-AβGFP(URA3), продуцирующими гибридные белки PrP(90-231)-GFP и Aβ40-GFPпод контролем промотора GPD [Nizhnikov et al., 2014]. Поскольку прион [PIN+]уверенно идентифицируется методом PSIA, сигнал, соответствующий белкуRnq1, может служить положительным контролем. В качестве отрицательногоконтроля использовали [pin-] дериват штамма BY4742, трансформированныйплазмидой pRS316CG [Liu and Lindquist, 1999], продуцирующей белок GFP подконтролем промотора CUP1.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
