Автореферат (1144699), страница 4
Текст из файла (страница 4)
Б –Изображение двумерного электрофореза белков,образующих саркозинат-устойчивые агрегаты. Белкииз штаммов GT81-1C [PSI+][PIN+] и GT409 [psi-][pin-]окрашены флуорохромами Cy5 и Cy3, соответственно.В – Изображение одномерного электрофореза, белков,образующихSDS-устойчивыеагрегаты,нерастворимые в буфере с хаотропными агентами.Таблица 2. Идентификация масс-спектрометрией белков, формирующих SDSустойчивые агрегаты в штаммах GT81-1C [PSI+][PIN+] и GT409 [psi-][pin-].БелокСчѐт1Идентифицированв Идентифицирован в++штамме [PSI ][PIN ]штамме [psi-][pin-]Ape1126++Ape493++Gas1151++Rnq1*109+1Примечания: Здесь и далее - счѐт – показатель, отражающий достоверностьидентификации белка методом масс-спектрометрии.
Указан счѐт, с которымбыли идентифицированы белки в образце из штамма GT81-1C [PSI+][PIN+].* Белок выявлен и идентифицирован только в штамме GT81-1C [PSI+][PIN+](здесь и далее для таблиц 2 - 4).15Таблица 3. Идентификация белков, выявленных на одномерном электрофорезев штаммах GT81-1C [PSI+][PIN+] и GT409 [psi-][pin-] (рис. 7В), методом массспектрометрии.БелокСчѐт Идентифицирован в Идентифицированв++штамме [PSI ][PIN ]штамме [psi ][pin ]Nop1160++Rpl28130++Rpl388++Rps2666++Sup35* 143+Tef2129++Таким образом, мы показали, что прионные агрегаты Sup35 демонстрируютвысокий уровень устойчивости к обработке хаотропными агентами (8 Mмочевина, 2 M тиомочевина и 4% CHAPS) [Nizhnikov et al., 2014].Несмотря на эффективность и удобство для демонстрации результатов,этот метод имеет определѐнные ограничения.
Белки с экстремальнойизоэлектрической точкой (ниже 3,5 и выше 9,5) не разделяются с помощьюдвумерного электрофореза и выпадают из анализа. Кроме того, белки, которыепродуцируются на крайне низком уровне, могут, не детектироваться на геле.Для того, чтобы повысить разрешающую способность методики, мыотказались от использования двумерного электрофореза. Фракцию белков,образующих агрегаты устойчивые при комнатной температуре к обработке 1%SDS, растворяли в концентрированной муравьиной кислоте, высушивали ввакуумном испарителе и денатурировали кипячением в буфере с 2% SDS. Далеепробы обессоливали, расщепляли на пептиды с помощью трипсина, пептидыразделяли на колонке HPLC и идентифицировали с помощью массспектрометрии.
Такой подход лишѐн недостатков, которые возникают прииспользовании двумерного электрофореза и позволяет идентифицироватьбелки, представленные в пробах даже в следовых количествах. В таблице 4представлены лишь первые 30 белков, идентифицированных с самым высокимсчѐтом с помощью новой модификации нашего метода (PSIA HPLC-MALDI) вштамме GT81-1C [PSI+][PIN+] и его изогенном деривате GT409 [psi-][pin-].
Вштамме [PSI+][PIN+], но не в его изогенном деривате [psi-][pin-], былиидентифицированы белки Sup35 и Rnq1 - детерминанты прионных факторов[PSI+] и [PIN+], соответственно, а также белки Sis1, Ssb1, Ssb2 и Ssa1. Известно,что шапероны Sis1, Ssb1, Ssb2 и Ssa1 взаимодействуют с прионнымиагрегатами белка Sup35 [Newnam et al., 1999; Sondheimer et al., 2001]. Такимобразом, выявление этих шаперонов методом PSIA объясняется их физическимвзаимодействием с прионом [PSI+]. Разработанный нами метод впервыепозволил оценить возможность присутствия в клетках прионов, не имеющих16фенотипического проявления. По всей вероятности, прионизация являетсяредким событием – в штаммах [PSI+][PIN+] идентифицированы белки Sup35 иRnq1, но, помимо шаперонов, не выявлено других белков, по которымразличаются фракции SDS-устойчивых агрегатов тестируемых штаммов.
Мысоставили список перспективных кандидатов на роль функциональныхдрожжевых амилоидов. В этот список входят белки Gas1, Tif1, Ecm33, Rim1,Toh1, Plb1, Gas5, Gas3, Ape1, Ilv2, Ira1, Utp20, YBL100W-B и Mlp1. Белки Gas3,Gas5, Ecm33 и Toh1, также как и Gas1, являются белками клеточной стенки[Nuoffer et al., 1991; Rolli et al., 2010; Terashima et al., 2003; Hamada et al., 1998].Таблица 4.
Белки, формирующие SDS-устойчивые агрегаты в штаммах GT811C [PSI+][PIN+] и GT409[psi-][pin-], идентифицированные методом PSIA HPLCMALDIБелокСчѐтИдентифицирован Идентифицированв штамме [PSI+]в штамме [psi-]869Sup35*+Gas1623++Tif1559++Sis1551+485Rnq1*+Ecm33438++Rim1406++Toh1376++Plb1355++Gas5316++Gas3292++222+Ssb1*204+Ssb2*Ape1195++Ilv2174++Ira1147++Utp20126++YBL100W-B 110++Mlp1110++103+Ssa2*Примечания те же, что к таблице 3.
Указаны показания счѐта массспектрометрии для образца из штамма GT81-1C [PSI+][PIN+].Особый интерес представляет белок Toh1. Продукция этого белка резкоусиливается при повреждениях клеточной стенки, а также при остановкеклеточных делений [Tkach et al., 2012]. Можно предположить, что17формирование амилоидных фибрилл белка Toh1 в клеточной стенке помогаетклетке пережить стресс. Полученные результаты позволяют заключить, чторазработанный метод может быть успешно использован для протеомногоскрининга и идентификации белков, формирующих прионные агрегаты.Идентификация прионов в штамме [NSI+]Мы использовали метод PSIA HPLC-MALDI для выявления белков,которые могут являться детерминантами прионного фактора [NSI+].
Фракциябелков, формирующих агрегаты, устойчивые к инкубации с 1% SDS, былавыделена из штаммов 1-1-D931 [NSI+] и 1-1-1-D931 [nsi-] как описано впредыдущем разделе. В штамме [NSI+], но не в контрольном штамме [nsi-],были идентифицированы белки Rnq1, Swi1, Mit1 и Sis1 (таблица 5). Белки Rnq1и Swi1 являются детерминантами прионов [PIN+] и [SWI+], соответственно[Derkatch et al., 2001; Due et al., 2008]. Mit1 входит в список потенциальноприоногенныхбелков,посколькусодержитQ/N-обогащѐннуюпоследовательность [Harrison and Gerstein 2003].
Шаперон Sis1 согласнолитературным данным взаимодействует с различными дрожжевыми прионами[по: Higurashi et al., 2008] и в результате этого выявлятся методом PSIA HPLCMALDI в прионсодержащих штаммах (табл. 4 и 5). Основываясь на этихданных, можно исключить белок Sis1 из списка кандидатов на рольдетерминанта фактора [NSI+]. Таким образом, белки Rnq1, Swi1 и Mit1являются кандидатами на роль детерминанта фактора [NSI+].
Мы провелисравнительный анализ агрегации этих белков в штаммах [NSI+] и [nsi-].Таблица 5. Различия штаммов [NSI+] и [nsi-] по составу белков,идентифицированных во фракции SDS-устойчивых агрегатов.БелокСчѐт Идентифицирован в Идентифицированв+штамме [NSI ]штамме [nsi ]Rnq1460+Sis1143+Swi165+Mit161+Мы показали, что SDS-устойчивые агрегаты Rnq1-CFP выявляются вштамме [NSI+], но не [nsi-] (рисунок 8А). Агрегация Swi1-YFP в штамме [NSI+] иотсутствие агрегатов этого белка в штамме [nsi-] было показано с помощьюметода дифференциального центрифугирования (рисунок 8Б). На основанииэтих данных можно заключить, что штаммы [NSI+] содержат белки Rnq1 и Swi1в принной изоформе [PIN+] и [SWI+], соответственно.Анализ агрегации белка Mit1-GFP был проведѐн как с помощью методадифференциального центрифугирования, так и методом полуденатурирующего18электрофореза.
Результаты, представленные на рисунке 8Г, свидетельствуют отом, что белок Mit1-GFP агрегирует как в штамме [NSI+], так и [nsi-]. Уровеньагрегации белка Mit1 в штаммах [NSI+] и [nsi-] не различается. Лишь небольшаядоля белка Mit1-GFP оказывается устойчива к обработке SDS (рисунок 8В).Полученные результаты свидетельствуют, что белок Mit1 не являетсядетерминантом [NSI+].
На основании полученных данных можнопредположить, что признаки, наблюдаемые в штаммах [NSI+], опосредованыприонами [PIN+] и [SWI+].Рисунок 8. Сравнительный анализ агрегации белков Rnq1-CFP, Swi1-YFP иMit1-GFP в штаммах [NSI+] и [nsi-]. А – Белок Rnq1-CFP формирует SDSустойчивые полимеры в штамме [NSI+], но не в штамме [nsi-].
Б - в штамме[NSI+] белок Swi1-YFP представлен в осадочной фракции («О» - осадочнаяфракция), содержащей высокомолекулярные белковые агрегаты, а в штамме[nsi-] представлен в надосадочной растворимой фракции («Н» - надосадочнаяфракция). В – лишь небольшая доля белка Mit1-GFP выявляется во фракцииSDS-устойчивыхполимеров.Г–Методомдифференциальногоцентрифугирования установлено, что белок Mit1-GFP представлен в осадочнойфракции как в штамме [NSI+], так и [nsi-].Для проверки возможного влияния приона [PIN+] на проявление фактора[NSI+] был получен штамм 7-1-1-D931 с делецией гена RNQ1.
Делеция генаRNQ1 вызвала резкое снижение уровня нонсенс-супрессии (рис. 9). Рост насреде без аденина детектируется лишь на пятый день. Последующаятрансформация данного штамма плазмидой, содержащей ген RNQ1, неприводит к восстановлению темпов роста на среде без аденина. Таким образом,19как делеция гена RNQ1, так и потеря фактора [PIN+], приводят к резкомуослаблению супрессорного фенотипа.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
