Автореферат (1144699), страница 6
Текст из файла (страница 6)
Для удобства демонстрации полученныхрезультатов, была использована модификация метода PSIA, включающаядвумерный электрофорез белков, окрашенных флуорохромами. Белки из«опытных» образцов, содержащих белки Aβ-GFP или PrP(90-231)-GFP,окрашивали флуорохромом Cy5 (красный), а белки из контрольного образцазелѐным флуорохромом Cy3.
Белки Aβ-GFP и PrP(90-231)-GFP были выявленыво фракции белковых агрегатов, устойчивых к обработке 3% саркозинатомнатрия (рис. 14; таблица 6), но не обнаружены при обработке белковых лизатов1% SDS (не представлено).Таблица 6. Идентификация методом масс-спектрометрии белков,формирующих агрегаты устойчивые к обработке саркоазинатом натрия, вштаммах BY4742 / PGPD-Aβ-GFP(URA3) и BY4742 / pGPD-PrP(90–231)-GFPШтаммБелокСчѐтBY4742 / pU-Ab-GFPAb-GFP137Rnq1215BY4742 / pGPD-PrP(90–231)-GFPPrP(90–231)-GFP 310Rnq19424Рисунок 14.
Изображения двумерных гель-электрофорезов белков, выделенныхметодом PSIA из штамма BY4742, трансформированного плазмидами,продуцирующими белки Aβ-GFP (А) и PrP(90-231)-GFP (Б) и из его деривата[pin-]. Белки, выделенные из штамма BY4742 [PIN+] и его деривата [pin-],метили флуорохромами Cy5 и Cy3, соответственно.Эти результаты соответствуют ранее полученным данным, согласно которымамилоидные конформеры пептида Aβ устойчивы к обработке саркозинатом, норастворимы в SDS [Coalier et al., 2013]. Таким образом, метод PSIA достаточноуниверсален и может быть использован для идентификации различных белков,формирующих амилоидные полимеры [Nizhnikov et al., 2014].Оценка амилоидных характеристик и анализ взаимодействия in vivoамилоидных агрегатов белка PrP с пептидом Aβ в дрожжах S.
cerevisiaeБелок PrP и пептид Aβ взаимодействуют друг с другом лишь в томслучае, когда один из партнѐров представлен в амилоидной конформации[Morales et al., 2010]. Взаимодействие олигомеров Aβ с мономерами PrPC, повсей видимости, способствует гибели нейронов в случае болезни Альцгеймера[Lauren et al., 2009; Kudo et al., 2013]. Это взаимодействие хорошо изучено ивыявлены короткие последовательности PrP23–30аа и PrP95–110аа,ответственные за связывание патологических олигомеров Aβ с мономерами PrP[Lauren et al., 2009; Chen et al., 2010]. Поскольку взаимодействие PrP с Aβзависит от конформационных изменений этих белков, следует ожидать, что зафизическое взаимодействие агрегатов PrPSc с Aβ отвечают иныепоследовательности.
Мы исследовали взаимодействие агрегатов PrP с пептидомAβ в дрожжевой модельной системе.Методом дифференциального центрифугирования и иммуноблотинга сиспользованием антител, распознающих GFP, YFP и CFP, мы показали, что25белки PrP23–231-CFP, PrP28–231-CFP, PrP90–231-CFP, PrP110–231-CFP и AβYFP формируют в дрожжевой клетке высокомолекулярные нерастворимыеагрегаты, которые детектируются в основном в осадочной фракции “Pellet”,тогда как белок CFP выявляется исключительно в растворимой фракции“Soluble” (рис.
15А) [Рубель и др. 2012; Rubel et al., 2013].Для оценки амилоидных свойств исследуемых белков мыохарактеризовали устойчивость агрегатов к обработке ионными детергентами ипротеиназой К. С помощью метода полуденатурирующего электрофореза мыпоказали, что все исследуемые белки формируют агрегаты, устойчивые к 3%саркозинату натрия (рис.
15Б), но не к 1% SDS (результат не представлен).Более того, после обработки гибридных белков PrP-CFP протеиназой К, вконцентрации 50 µg/ml интактным остаѐтся фрагмент PrP размером 19-20 KDa(рис. 15В).Рисунок 15. Белки PrP23–231-CFP, PrP28–231-CFP, PrP90–231-CFP, PrP110–231-CFP и Aβ-YFP демонстрируют амилоидные характеристики при продукциив клетках дрожжей. А – анализ агрегации исследуемых белков методомдифференциального центрифугирования.
Б – Выявление детергент устойчивыхполимеров исследуемых белков методом полуденатурирующего электрофореза.В - Анализ устойчивости исследуемых белков к обработке протеиназой К вразличных концентрациях.Такой же фрагмент, размером 19-20 KDa, соответствующийпоследовательности PrP(90-231), был выявлен раньше при продукции белкаPrP(23-231) в мозге больных млекопитающих и в клетках S. cerevisiae [Ma andLindquist, 1999].
Белок Aβ-YFP также демонстрирует высокий уровеньустойчивости к обработке протеиназой К (рис. 15В). На основании полученных26результатов можно заключить, что исследуемые белки (PrP23–231-CFP, PrP28–231-CFP, PrP90–231-CFP, PrP110–231-CFP и Aβ-YFP) при продукции вдрожжах демонстрируют амилоидные характеристики [Rubel et al., 2013].Для анализа взаимодействия агрегатов PrP с пептидом Aβ штамм BY4742был котрансформирован попарно плазмидой pGPD-Aβ-YFP(URA3) и одной изплазмид, продуцирующих химерные белки PrP23–231-CFP, PrP28–231-CFP,PrP90–231-CFP и PrP110–231-CFP [Rubel et al., 2013]. Частоты колокализацииоценивали с помощью флуоресцентной конфокальной микроскопии. Приподсчѐте частот колокализации учитывали клетки, которые одновременносодержали агрегаты PrP-CFP, и сигналы, соответствующие Aβ-YFP.
АгрегатыPrP23–231-CFP, PrP28–231-CFP и PrP90–231-CFP колокализовались сгибридным белком Aβ-YFP с высокой частотой (от 75 до 85%) (рис. 16).Частота колокализации агрегатов PrP110–231-CFP с белком Aβ-YFP примернов пять раз ниже (около 17%) (рис. 16).Рисунок 16.
Анализ колокализации агрегатов белков PrP23–231-CFP, PrP28–231-CFP, PrP90–231-CFP и PrP110–231-CFP с белком Aβ-YFP. А- фотографииклеток, ко-продуцирующих исследуемые белки. Б – Диаграмма, отражающаячастоты колокализации исследуемых белков. Указаны достоверные различия (p< 0,05) и ошибка среднего.Из этих данных следует, что последовательность PrP90-109 необходима дляэффективного взаимодействия агрегатов PrP с пептидом Aβ.Физическое связывание агрегатов гибридных белков PrP-CFP с Aβ-YFPисследовали с помощью метода AB FRET (Acceptor Photobleaching FluorescenceResonance Energy Transfer). Метод AB FRET основан на том, что при облучении27донора (CFP) перенос энергии к реципиентной молекуле (YFP) происходитлишь в том случае, когда расстояние между этими молекулами составляетменее 10нм.
Детекция переноса энергии методом AB FRET свидетельствует офизическом взаимодействии исследуемых белков. Клетки, копродуцирующиеPrP23–231-CFP с PrP23–231-YFP, а также PrP23–231-CFP с YFP, былииспользованы в качестве позитивного и негативного контроля, соответственно.Наибольший показатель AB FRET (11.5%) отмечен в клетках, используемых вкачестве положительного контроля (рис. 17). Эффективность AB FRET вклетках, ко-продуцирующих белки PrP23–231-CFP и Aβ-YFP, а также PrP28–231-CFP и Aβ-YFP, составляет примерно 6%, тогда как этот показатель вклетках, содержащих белки PrP90–231-CFP и Aβ-YFP или PrP110–231-CFP иAβ-YFP, был значительно ниже и не отличался от негативного контроля (рис.17).
Таким образом, фрагмент PrP28-89, также как PrP90-109, играет роль врегуляции взаимодействия агрегатов PrP с пептидом Aβ [Rubel et al., 2013].В результате работы был выявлен интересный парадокс – агрегатыPrP90–231-CFP с высокой частотой колокализуются с белком Aβ-YFP (рис. 16),тогда как физическое взаимодействие между ними не детектируется(показатели AB FRET не отличаются от негативного контроля) (рис. 17).Рисунок 17.Сравнительныйанализфизическоговзаимодействияагрегатов белковPrP23–231-CFP,PrP28–231-CFP,PrP90–231-CFP иPrP110–231-CFP сAβ-YFP.
Указаныдостоверныеразличия (p < 0,05)и ошибкасреднего.Для объяснения этого парадокса мы предложили гипотезу, согласно которойагрегаты PrP90–231-CFP не связывают мономеры Aβ, а взаимодействуют лишьс агрегатами этого пептида. Метод AB FRET позволяет детектировать переносэнергии при взаимодействии агрегатов PrP с мономерами Aβ, но присвязывании предсуществующих агрегатов Aβ-YFP среднее растояние междумолекулами PrP и Aβ оказывается больше 10нм и перенос энергии недетектируется [Rubel et al., 2013].28На основании результатов, представленных в этом разделе, можносделать вывод, что дрожжи S. cerevisiae являются удобной и адекватноймоделью для исследования агрегации и физического взаимодействиягетерологичных амилоидных белков in vivo.ЗАКЛЮЧЕНИЕПолученные в работе данные дополняют теорию белковойнаследственности.
Согласно этой теории, изменение конформации белка можетподдерживаться автокаталитически и вызывать наследуемые измененияпризнаков у микроорганизмов. Иными словами, наследуемые изменения могутвозникать без каких-либо мутаций в последовательности нуклеиновых кислот.Наши результаты позволяют предложить концепцию, согласно которой нетолько прионизация одного белка, но и функциональное взаимодействиеразличных прионов вызывает наследуемые изменения признаков. Более того,мы показали, что взаимодействия прионов могут быть описаны в рамкахтрадиционной классификации генных взаимодействий. В отношении признака«супрессия нонсенс-мутации ade1-14 (UGA)» прионы [PIN+] и [SWI+]демонстрируют комплементарное взаимодействие – прион [PIN+] усиливает(дополняет) действие приона [SWI+] на исследуемый признак. Согласно нашимданным, имеет место не физическое связывание прионных детерминантов, афункциональное взаимодействие, опосредованное различными компонентамипротеомных сетей.В ходе работы мы охарактеризовали не только новое проявление прионов+[PIN ] и [SWI+], но и показали, что прионная конверсия белков Rnq1 и Swi1приводит к появлению новой функциональной активности этих белков.
БелокRnq1 только в прионной форме влияет на агрегацию Swi1 и усиливает эффектприона [SWI+] на супрессию нонсенс-мутации ade1-14 (UGA). ПрионизацияSwi1, в свою очередь, вызывает супрессию нонсенс-мутации trp1-289 (UAG), иэта функция не зависит от инактивации Swi1.Мы разработали и успешно апробировали метод PSIA, позволившийидентифицировать прионные белки, взаимодействие которых определяетизменения признака, а также выявить ряд белков, являющихся кандидатами нароль конститутивных дрожжевых амилоидов. Разработанный нами методвпервые позволил оценить масштабность прионного феномена у исследуемыхорганизмов.
Теоретически можно было ожидать, что помимо ужеохарактеризованных прионов в дрожжевых клетках могут присутствоватьприонные конформеры белков, агрегация которых не вызывает видимыхэффектов. Из полученных нами результатовможно заключить, чтоприонизация является редким событием.Выявление списка кандидатов на роль дрожжевых функциональныхамилоидов открывает широкие перспективы для дальнейших исследований.29Важно отметить, что возможность применения метода PSIA не ограничиваетсяединственным объектом. В настоящее время этот метод уже используется дляпоиска функциональных и патологических амилоидов в клетках дрожжей ибактерий, а также в мозге млекопитающих.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
