Автореферат (Идентификация и анализ взаимодействия прионов и амилоидов в протеоме дрожжей saccharomyces cerevisiae), страница 2

Автор внѐс основной вклад в планирование, получениеи интерпретацию результатов и является первым или основным автором 12работ опубликованных по теме диссертации. В работе по протеомномускринингу амилоидов идентификация белков с помощью масс-спектрометриипроводилась специалистами ЦКП института ФХБ им. А.Н. Белозѐрского МГУ иРЦ «Развития молекулярных и клеточных технологий» СПбГУ.Структура и объѐм диссертации. Диссертация изложена на 204 страницахмашинописного текста и включает «Введение», «Обзор литературы»,«Материалы и методы», «Экспериментальные исследования и обсуждение»,«Заключение», «Выводы», «Список сокращений» и «Список литературы».

Втексте представлено 35 рисунков и 20 таблиц. Список литературы содержит 287источников из них 278 на английском языке.ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫМатериалы и методыВ работе использованы стандартные методы классической и молекулярнойгенетики дрожжей и разработаны новые подходы для протеомного скрининга иидентификации амилоидов у различных организмов. В частности, в работеиспользовали классические методы культивирования E.coli и S. cerevisiae[Захаров и др., 1984; Rose et al., 1990], стандартный набор методов геннойинженерии [Sambrook et al., 1989], различные вариации методов выделениябелка, электрофореза в агарозном и акриламидном геле, Вестерн-блотгибридизации [Rubel et al., 2013].

Генотипы штаммов представлены в таблице 1.Таблица 1. Штаммы S. cerevisiae, использованные в работеШтаммы Генотип, эпигенетические детерминанты, описание1-D931MATa sup35Δ::HIS3 ade1-14 his3 leu2 lys2 ura3 trp1-289 [pU-AβSup35MC] [PIN+]1-1-D931 [NSI+] дериват штамма 1-D931BY4742MATα his3-Δ1 leu2-Δ0 lys2-Δ0 ura3-Δ0 [psi-][PIN+]7B-D901 MATa ade2-28 his3 LEU2 lys 9-21 ura3-525 trp1 cyhR kar1-1 [pin-]GT81-1C MATa ade1–14 his3-Δ200 leu2–3,112 lys2 trp1–289 ura3 [PSI+][PIN+]GT409[psi-][pin-] дериват штамма GT81-1CПрионный фактор [NSI+] был выявлен в штамме 1-1-D931 [NSI+], которыйявляется гаплоидным дериватом штамма GT111 [Chernoff et al., 2001]. Всеостальные штаммы [NSI+] использованные в работе являются производнымиштамма 1-1-D931, полученными за счѐт замены плазмиды pU-Aβ-Sup35MC,переключения типа спаривания, белковой трансформации, а также интеграции6в геном или делеции определѐнных генов. Производные штаммов, утратившиеприонные факторы [NSI+], [PIN+], [PSI+] и [SWI+], получены за счѐттрѐхкратного пассирования дрожжей на среде с 5мМ GuHCL (хлоридомгуанидина), либо в результате делеции гена HSP104.

Описания всех плазмидпредставлены в статьях, на которые приведены ссылки.Для сравнительного анализа уровня транскрипции исследуемых генов, атакже для оценки эффективности терминации трансляции, использовалиметоды ПЦР в реальном времени [Livak and Schmittgen, 2001] и бицистроннойлюминесценции [Valouev et al. 2009], соответственно. Для анализавзаимодействия амилоидных белков in vivo применяли методы флуоресцентноймикроскопии и метод FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer) [Roszik etal., 2013]. Вычисление стандартного отклонения, ошибки среднего, а такжесравнение выборок при помощи непараметрического критерия Манна-Уитнипроводили при помощи пакета программного обеспечения “STATISTICA”версии 6.0.

(“StatSoft Inc.”, США). Разработана методология для выявления иидентификации в масштабах протеома белков, формирующих амилоидныеагрегаты in vivo [Nizhnikov et al., 2014]. Этот подход объединяет рядбиохимических и протеомных методов, в частности, ультрацентрифугированиебелкового лизата, очистку фракции детергент-устойчивых белковых агрегатов,двумерный электрофорез окрашенных флуорохромами белков, расщеплениесложных белковых смесей на пептиды, их разделение методом HPLC иидентификацию белков методом масс-спектрометрии.Результаты и обсуждениеВыявление и характеристика эпигенетического детерминанта [NSI+].Эпигенетичесикй детерминант, вызывающий нонсенс-супрессию, был выявленпри работе с дрожжевым штаммом 1-D931 (таблица 1), маркированнымнонсенс-мутациями ade1-14 и trp1-289 и содержащем плазмиду pU-ASUP35MC на фоне делеции хромосомной копии гена SUP35.

Гибридный генA-SUP35MC содержит последовательность, кодирующую амилоидный пептидбета человека, слитую в рамке с последовательностью, кодирующей домены Ми С белка Sup35 [Цапонина и др., 2005; Saifitdinova et al., 2010]. В отсутствииSup35 белок A-Sup35MC выполняет функцию фактора терминациитрансляции eRF1.

Ген A-SUP35MC находится под контролем промотораCUP1, который активируется добавлением ионов меди в питательную среду.Эффективность терминации трансляции оценивали в соответствии с темпамироста штамма на среде без аденина и без триптофана, что отражает частотыошибочного прочтения стоп-кодонов ade1-14(UGA) или trp1-289 (UAA), какзначащих (рис.1 А и Б). Как видно из результатов, представленных на рисунке1, темпы роста штамма на среде без аденина закономерно снижаются при7увеличении концентрации ионов меди в питательной среде, и, соответственно,с увеличением уровня продукции гибридного белка A-Sup35MC.Рисунок 1.

Нонсенс-супрессорныйфенотип штамма 1-D931 и егодеривата 1-1-D931,продуцирующих гибридный белокA-Sup35MC. А- Рост штамма 1D931 на среде без аденина сдобавлением сульфата меди вразличной концентрации.Результаты Вестерн-блотгибридизации с использованиемантител 4G8 отражают изменениеуровня продукции белка ASup35MC. Б – Рост штамма 1-1D931 на средах без аденина и безтриптофана с добавлением 150 µМ сульфата меди до и после пассированияклеток на среде с GuHCl.

В – Сравнительный анализ количества белка ASup35MC в клетках штаммов 1-D931 и 1-1-D931.Относительное количество белка A-Sup35MC в клетках штамма 1-D931при изменении концентрации ионов меди в среде оценивали методом Вестернблот гибридизации с использованием моноклональных антител 4G8,специфичных к пептиду Аβ (рис. 1А). При добавлении в среду 150 µМ сульфатамеди штамм 1-D931 не растѐт на среде без аденина и без триптофана (рис.1 А иБ). В результате отбора индивидуальных колоний мы выявили один клон,обозначенный 1-1-D931, демонстрирующий нонсенс-супрессорный фенотиппри добавлении в питательную среду даже 150 µМ сульфата меди (рис 1Б).Супрессия проявления нонсенс-мутаций ade1-14(UGA) и trp1-289 (UAG) небыла связана с изменением уровня продукции гибридного белка A-Sup35MC(рис 1В).

Нонсенс-супрессорный фенотип стабильно наследовался в митозе иэлиминировался в результате пассирования клеток исследуемого штамма насреде с 5mM хлоридом гуанидина (GuHCl) у 124 из 128 проанализированныхклонов (97%) (рис 1Б). GuHCl инактивирует АТФ-азную активность шаперонаHsp104 и вызывает элиминацию большинства известных дрожжевых прионов[по: Derkatch et al., 1997]. На основании этих фактов мы заключили, чтононсенс-супрессия в штамме 1-1-D931 детерминируется эпигенетическимфактором, который мы назвали [NSI+] (Nonsense Suppression Iducer).

Штаммы,не содержащие этот фактор, были обозначены [nsi-] [Saifitdinova et al., 2010].Анализ роста штаммов на средах с неферментируемыми источниками углерода8показал, что наличие фактора [NSI+] ингибирует рост штаммов на средах,содержащих в качестве источника углерода галактозу или глицерин (рис. 2).Элиминация фактора [NSI+] в результате пассирования штамма на среде сGuHCl приводит к восстановлению нормального темпа роста на средах снеферментируемыми источниками углерода (рис.

2) [Nizhnikov et al.2011].Рисунок 2. Рост штаммов 1-1-D931 [NSI+] и1-1-1-D931 [nsi-] на средах MD бездобавления аденина и триптофана, а такжена средах с галактозой (MG) и глицерином(MGly) в качестве источника углерода.Aβ-Sup35MC не является детерминантом фактора [NSI+].Пептид Аβ человека как в организме млекопитающих, так и при продукции вдрожжевых клетках, может формировать агрегаты [Bagriantsev and Liebman,2006; Porzoor and Macreadie, 2013]. Для проверки гипотезы, согласно которойфактор [NSI+] возник в результате прионной конверсии гибридного белка ASup35MC, мы провели сравнительный анализ агрегации этого белка в штаммах[NSI+] и [nsi-] при помощи метода дифференциального центрифугирования.

Дляэкспрессии гибридного гена A-SUP35MC здесь и во всех дальнейшихэкспериментах во все используемые среды добавляли 150 μМ сульфата меди.Как в штамме [NSI+], так и в штамме [nsi-] большая доля белка A-Sup35MCпредставлена в растворимой надосадочной фракции (рис.3А).Рисунок 3. Гибридный белок AβSup35MC не является детерминантомфактора [NSI+]. А – Сравнительныйанализ количества белка Aβ-Sup35MC вклетках штаммов [NSI+] и [nsi-] (Ннадосадочная, О –осадочная фракция).Б – Рост дрожжей на среде без аденинав эксперименте с последовательнойзаменой плазмид в штамме [NSI+].Плазмиду pL-Ab-SUP35MC замещали на плазмиду pYCH-U2, а затемпроводили обратную замену плазмид.Распределение белка между надосадочной и осадочной фракциями неразличается.

Таким образом, полученные результаты не подтверждаютгипотезу о том, что возникновение фактора [NSI+] связано с прионнойагрегацией A-Sup35MC. Как известно, делеция гена, кодирующегоприонформирующий белок, неизбежно приводит к элиминации приона9[Wickner et al., 1999]. Замена плазмиды pL-Aβ-Sup35MC [Saifitdinova et al.,2010] на центромерную плазмиду pYCH-U2, содержащую ген SUP35 подконтролем собственного промотора [Derckatch et al., 1997], вызвала потерюсупрессорного фенотипа (рис. 3Б), однако обратная замена плазмиды pYCH-U2на pL-Aβ-Sup35MC привела к полному восстановлению супрессорногофенотипа (рис. 3Б). Данные, полученные в этом эксперименте доказывают, чтопотеря гена, кодирующего белок Aβ-Sup35MC лишь маскирует проявление[NSI+], но не вызывает его элиминации.

На основании полученных результатовможно заключить, что гибридный белок Aβ-Sup35MC не являетсядетерминантом фактора [NSI+] [Saifitdinova et al., 2010].[NSI+] вызывает снижение эффективности терминации трансляцииДля выяснения возможной взаимосвязи проявления [NSI+] с регуляциейтерминации трансляции изогенные штаммы [NSI+] и [nsi-] былитрансформированы плазмидами pDB691 или pDB721, в составе которыхрасположены два гена, кодирующие различные люциферазы, и между нимивстроены стоп-кодоны UGA и UAG, соответственно [Keeling et al., 2004].Исследуемые штаммы трансформировали также плазмидами pDB690 илиpDB720, в которых на месте стоп-кодонов расположены значащие триплеты[Keeling et al., 2004].

Показатель, отражающий сравнительную активность двухлюцифераз в штаммах [NSI+] и [nsi-], вычисляли по стандартной методике[Keeling et al., 2004]. Полученные данные показали, что [NSI+] вызываетдостоверное увеличение частот прочтения стоп-кодонов UGA и UAG какзначащих (рис.4). Таким образом, детерминант [NSI+] вызывает снижениеэффективности терминации трансляции, и этот эффект может проявляться ввиде нонсенс-супрессии на фоне мутаций в гене SUP35, не имеющихсобственного проявления [Нижников идр.2013 А; Нижников и др.2013 Б].Рисунок 4. Сравнительный анализ частотсчитывания стоп-кодонов UGA и UAG какзначащих в штаммах [NSI+] и [nsi-].Прионные характеристики эпигенетического детерминанта [NSI+][NSI+], как и большинство дрожжевых прионов, эффективно элиминируетсяпри пассировании клеток на среде с GuHCl.