Автореферат (Хромосомная, клеточная и тканевая специфичность гидроксиметилирования ДНК в проэмбриональный и эмбриональный периоды развития человека), страница 5

Для изучения данного феномена проведено исследованиелокализации 5hmC в парах гомологичных хромосом 1 и 16. В парах гомологичных хромосомвыявлены различные типы локализации 5hmC:• оба гомолога не содержат 5hmC;• один из гомологов характеризуется асимметричным распределением 5hmC, другой несодержит 5hmC;• оба гомолога характеризуются асимметричным распределением 5hmC;• оба гомолога характеризуются симметричным распределением 5hmC;• один из гомологов характеризуется асимметричным распределением 5hmC, другой —симметричным;• один из гомологов характеризуется симметричным распределением 5hmC, другой несодержит 5hmC.Характер распределения 5hmC, включая симметричное и асимметричное, полное иличастичное гидроксиметилирование хромосомы/хроматиды, не был специфичен для какойлибо конкретной хромосомы. Соотношение числа пар гомологичных хромосом с различнымитипами распределения 5hmC оказалось сходным для хромосом 1 и 16.

Однако, присравнительном анализе числа пар гомологов хромосом 1 и 16 с различными типамираспределения 5hmC между клетками эмбрионального лёгкого и цитотрофобласта хорионаобнаружены тканеспецифичные особенности. Метафазные пластинки, где оба гомолога несодержали 5hmC, в клетках лёгкого встречались реже, чем в клетках хориона.Асимметричный тип распределения 5hmC на обоих гомологах оказался более характернымдля метафазных пластинок из клеток лёгкого по сравнению с цитотрофобластом хориона(рис. 12).

Это подтверждает предположение о том, что характер распределения 5hmCявляется уникальным для конкретного типа ткани. Явление асимметричногогидроксиметилирования хромосом может быть связано с делением и дифференцировкойклеток лёгкого и хориона. Изменение характера гидроксиметилирования хромосом, вероятно,происходит не однонаправлено в сторону потери 5hmC, а волнообразно, т.к. асимметричноераспределение 5hmC наблюдается у эмбрионов разных сроков развития — от 5 до 12 недель.Характергидроксиметилированияхромосомизэмбриональныхиэкстраэмбриональных тканей сходен с таковым у доимплантационных эмбрионов. Пассивнаяпотеря 5hmC при делениях дробления у доимплантационных зародышей и случайноераспределение гидроксиметилированных и негидроксиметилированных хроматид приводит ктому, что характер гидроксиметилирования отличается между разными бластомерами, какбыло показано нами ранее.

Пассивная потеря 5hmC в бластомерах является невосполнимой,т.к. не происходит гидроксиметилирования ДНК в течение всего периодадоимплантационного развития (Inoue, Zhang, 2011; Efimova et al., 2015). Однако характергидроксиметилированияхромосомвпостимплантационныхэмбриональныхиэкстраэмбриональных клетках указывают на нелинейное изменение уровня 5hmC.Сегментоспецифичная и межхромосомная гетерогенность распределения 5hmC, наблюдаемаяв настоящем исследовании, может быть связана с задержкой в образовании 5hmC из вновьобразовавшегося 5mC. В отличие от 5mC, который образуется на новосинтезированной цепиДНК сразу после репликации, для образования 5hmC на той же вновь синтезированной цепитребуется около 30 часов (Bachman et al., 2014). Таким образом, при активном делении клеток16эмбриональных и экстраэмбриональных тканей может наблюдаться неполное сохранениеуровнягидроксиметилирования.Дальнейшееслучайноераспределениегидроксиметилированных хроматид после митотических делений и СХО приводит касимметричному наследованию 5hmC дочерними клетками и «хаотическому»гидроксиметилированию хромосом в ткани.

Таким образом, образуется уникальный характерраспределения 5hmC в каждой клетке.Рисунок12.Соотношениеразличных типовраспределения5hmCнагомологичныххромосомах изклеток хориона иэмбриональноголёгкого.Т.о., в отличие от стабильного характера метилирования ДНК, распределение 5hmC наметафазных хромосомах из клеток эмбриональных и экстраэмбриональных тканейхарактеризуетсявыраженноймежхромосомной,межклеточнойимежтканевойвариабельностью, обусловленной различными комбинациями гидроксиметилированных,гемигидроксиметилированных и негидроксиметилированных хромосом.ЗАКЛЮЧЕНИЕНастоящая работа выполнена в рамках исследования эпигенетической реорганизациигенома в проэмбриональный и эмбриональный периоды развития человека. С помощьюкомплексного подхода с применением различных методов были охарактеризованыдифференциальное распределение 5hmC на метафазных хромосомах, а так же егодинамические изменения в гаметогенезе и раннем эмбриогенезе.Установлено,чтозапрограммированноегидроксиметилированиеДНКвсперматогенных клетках человека происходит волнообразно на двух стадияхдифференцировки: в сперматогониях и сперматидах.

На завершающих стадиях спермиогенезапоявление сперматозоидов, содержащих 5hmC, происходит спонтанно, и, по-видимому,определяется повреждающим действием внешних факторов. На это указывает ассоциациясперматозоидов, содержащих 5hmC, с плохим качеством гамет и высокой долейсперматозоидов с фрагментированной ДНК. Таким образом, в рамках настоящегоисследования впервые показано, что высокая доля в эякуляте сперматозоидов, содержащих5hmC, является негативным прогностическим критерием фертильности. Оценка качествасперматозоидов, выполненная с применением нового критерия, позволяет улучшитьключевой этап вспомогательных репродуктивных технологий — направленную селекциюгамет для повышения эффективности ЭКО и рождения здорового ребенка.

Выявленные внастоящей работе различия в содержании 5hmC в сперматозоидах доноров спермы и17пациентов с нарушениями фертильности являются редпосылкой к изучению механизмоввзаимодействия эпигенетических изменений в мужских гаметах и нарушенийрепродуктивной функции, а также поиску новых способов лечения мужского бесплодия спомощью лекарственных средств и подбора диеты.Впервые показаны глобальные изменения эпигенома человека после оплодотворения.Распределение 5hmC на хромосомах устанавливается de novo в соответствии с родительскимпроисхождением хромосомы и зависит от типа сегмента.

Хромосомы разнородительскогопроисхожденияподвергаютсяконтрастнымизменениям:отцовскиехромосомыгипергидроксиметилированы и гипометилированы, а материнские напротив —гипогидроксиметилированы и гиперметилированы. В ходе делений дробления вплоть достадии бластоцисты деметилирование генома зародыша происходит за счёт как активногодеметилирования посредством формирования 5hmC, так и зависимой от репликациипассивной потери 5hmC и 5mC, с образованием гемиметилированных игемигидроксиметилированных хромосом. Эти преобразования строго запрограммированы и,по-видимому, необходимы для реализации наследственной информации генома зародыша. Входе постимплантационного развития установлен уникальный феномен асимметрии рисункагидроксиметилирования хромосом, при этом ярко выражена гетерогенность на уровнехромосом, метафазных пластинок и тканей, обусловленная различными комбинациямигидроксиметилированных, гемигидроксиметилированных и негидроксиметилированныххромосом.Таким образом, впервые описанные изменения гидроксиметилирования ДНК впроэмбриональный и эмбриональный периоды свидетельствую об эпигенетическомрепрограммировании генома важном для корректной реализации генетической информации впрограмме индивидуального развития человека.ВЫВОДЫ1.

Специфический для стадии зиготы человека характер распределения 5гидроксиметилцитозина на метафазных хромосомах не наследуется из гамет, аустанавливается de novo и определяется как родительским происхождением, так и типомсегмента хромосом. 5-гидроксиметилцитозин локализован в R-, но не G- и C-сегментах.Метафазныехромосомыотцовскогопроисхожденияподвергаютсяактивномудеметилированию с образованием 5-гидроксиметилцитозина в большей степени, чемметафазные хромосомы материнского происхождения.2. В деметилировании генома доимплантационных зародышей человека участвует не менеетрёх механизмов: активное деметилирование с образованием 5-гидроксиметилцитозина настадии зиготы, а также пассивная потеря 5-гидроксиметилцитозина с образованиемгемигидроксиметилированных хромосом и пассивная потеря 5-метилцитозина собразованием гемиметилированных хромосом при делениях дробления до стадиибластоцисты.3.

В постимплантационном эмбриональном развитии человека гидроксиметилирование ДНКхарактеризуетсявыраженноймежхромосомной,межклеточнойимежтканевойвариабельностью, обусловленной различными комбинациями гидроксиметилированных,гемигидроксиметилированных и негидроксиметилированных хромосом.4. В ходе дифференцировки сперматогенных клеток человека происходят волнообразныеизменения характера гидроксиметилирования ДНК: 5-гидроксиметилцитозин характерен длясперматогониев Ad, утрачивается к моменту вступления в митоз, отсутствует в мейотическиделящихся сперматоцитах, а затем снова появляется в небольшой доле сперматид.5.

Гидроксиметилирование ДНК характерно для небольшой доли эякулированныхсперматозоидов. Увеличение этой доли ассоциировано со снижением качества эякулята инарушениями фертильности.6. В сперматогенезе человека изменения характера гидроксиметилирования ДНК происходятстрого запрограммировано в ходе дифференцировки сперматогенных клеток, а появление вэякуляте отдельных гидроксиметилированных сперматозоидов является следствием еёнарушения.18СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИСтатьи:1.

Ефимова О.А., Пендина А.А., Тихонов А.В., Кузнецова Т.В., Баранов В.С.Метилирование ДНК – основной механизм репрограммирования и регуляции геномачеловека // Медицинская генетика. – 2012. – Т. 11, №4. – С. 10-18.2. Ефимова О.А., Пендина А.А., Тихонов А.В., Кузнецова Т.В., Баранов В.С.