Автореферат (Хромосомная, клеточная и тканевая специфичность гидроксиметилирования ДНК в проэмбриональный и эмбриональный периоды развития человека)

На правах рукописиТихонов Андрей ВладимировичХРОМОСОМНАЯ, КЛЕТОЧНАЯ И ТКАНЕВАЯ СПЕЦИФИЧНОСТЬГИДРОКСИМЕТИЛИРОВАНИЯ ДНК В ПРОЭМБРИОНАЛЬНЫЙ ИЭМБРИОНАЛЬНЫЙ ПЕРИОДЫ РАЗВИТИЯ ЧЕЛОВЕКАспециальность: 03.02.07 – генетикаАВТОРЕФЕРАТдиссертации на соискание ученой степеникандидата биологических наукСанкт-Петербург — 2018Работа выполнена на кафедре генетики и биотехнологии биологического факультетаФедеральногогосударственногобюджетногообразовательногоучреждениявысшегообразования «Санкт-Петербургский государственный университет» и в лабораториипренатальной диагностики наследственных и врожденных болезней ФГБНУ «НИИакушерства, гинекологии и репродуктологии им. Д.О.

Отта».Научный руководитель:член-корреспондент РАН, з.д.н., д.м.н., профессорБаранов Владислав Сергеевичзаведующий лабораторией пренатальной диагностикинаследственных и врожденных болезнейФГБНУ «НИИ акушерства, гинекологии и репродуктологииим. Д.О.Отта», г. Санкт-ПетербургОфициальныедоктор биологических наукКозикова Лариса Васильевнадоцент,ведущийнаучныйсотрудниклабораториимолекулярнойгенетикиВсероссийскогонаучноисследовательского института генетики и разведениясельскохозяйственныхживотныхфилиалФГБНУ«Федеральный научный центр животноводства – ВИЖ имениакадемика Л.К.Эрнста», г. Санкт-Петербург, г.

Пушкиноппоненты:кандидат биологических наукБоголюбова Ирина Олеговнадоцент, старший научный сотрудник лаборатории морфологииклеткиФедеральногогосударственногобюджетногоучреждения науки Институт цитологии Российской академиинаук, г. Санкт-ПетербургВедущая организация:Федеральное государственное бюджетное научное учреждение«Институт экспериментальной медицины», г.

Санкт-ПетербургЗащита диссертации состоится «___» ___________ 2018 г. в ____ часов на заседании советаД.212.232.12 по защите докторских и кандидатских диссертаций при Санкт-Петербургскомгосударственном университете по адресу: 199034, Санкт-Петербург, Университетская наб.,7/9, СПбГУ, биологический факультет, ______________________________________________.С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке им.

М. Горького СанктПетербургского государственного университета по адресу: 199034, Санкт-Петербург,Университетская наб., д. 7/9. Диссертация и автореферат диссертации размещены на сайтеСПбГУ: https://disser.spbu.ru/disser/soiskatelyu-uchjonoj-stepeni/dis-list/details/14/1686.htmlАвтореферат разослан «___» ____________ 2018 г.Ученый секретарьДиссертационного совета Д.212.232.12кандидат биологических наук, доцентС.А.Галкина2ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫАктуальность темы исследования.

Онтогенез млекопитающих начинается соплодотворения — слияния двух высокоспециализированных клеток — ооцита исперматозоида, в результате которого формируется тотипотентная зигота. В основеспособности зиготы дать начало новому организму с более чем 200-ми типами клеток лежитсложная и скоординированная работа механизмов, регулирующих функции генома иустанавливающих специфические для клеточных линий профили экспрессии генов.Ключевую роль в определении судьбы клеток играют эпигенетические модификации ДНК ибелков хроматина (Nashun et al., 2015).В отличие от генетической информации, одинаковой во всех клетках организма и внорме и не претерпевающей изменений в онтогенезе, эпигеном является пластичной ивысокодинамичной системой, подверженной как запрограммированным, так и спонтаннымизменениям.

В онтогенезе млекопитающих дважды — в гаметогенезе и раннем эмбриогенезе— происходит репрограммирование эпигенома: глобальные изменения, во время которыхстираются предсуществующие эпигенетические паттерны и устанавливаются новые (Reik,2007; Lange, Schneider, 2010). Эти «волны» эпигенетического репрограммирования являютсянеотъемлемой частью программы развития и обеспечивают непрерывность передачигенетической информации, делая возможным переходы от высокоспециализированных гаметк тотипотентной зиготе, а затем от соматических клеток к половым. В то же время,воздействие как экзо-, так и эндогенных факторов способно приводить к спонтанномуизменению эпигенетических паттернов, и как следствие, нарушению профилей экспрессиигенов (Jefferson et al., 2013).

Очевидно, что в периоды эпигенетического репрограммированиягенома эффект от таких воздействий будет наиболее выраженным.Ключевой эпигенетической модификацией генома млекопитающих являетсяметилирование ДНК, которое осуществляют ферменты ДНК-метилтрансферазы,катализирующие присоединение метильной группы в пятом положении цитозина, врезультате чего образуется 5-метилцитозин (5mC) (Ванюшин, 2006; Senner, 2011).Метилирование ДНК участвует не только в регуляции генетической активности, но иконтролируетразнообразныебиологическиепроцессы,включаяклеточнуюдифференцировку, поддержание стабильности генома, репликацию, защиту генома отмобильных генетических элементов, онкогенез и геномный импринтинг (Reik et al., 2001;Goll, Bestor, 2005; Straussman et al, 2009).

5mC, в свою очередь, может подвергатьсяокислению белками ТЕТ (Ten-Eleven-Translocation), в результате которого последовательнообразуются три кислородсодержащих производных — 5-гидроксиметилцитозин (5hmC), 5формилцитозин (5fC) и 5-карбоксилцитозин (5caC). 5fC и 5caC являются мишенями длясистемы эксцизионной репарации, которая вырезает их из ДНК, заменяя нанемодифицированный цитозин (Tahiliani et al., 2009; Ito et al., 2011). ТЕТ-опосредованноеокисление 5mC является механизмом активного (ферментативного) деметилирования ДНК —одного из ключевых этапов эпигенетического репрограммирования генома гамет и эмбрионовмлекопитающих.

Установлено, что продукты окисления 5mC выполняют не только рольпромежуточных звеньев в цепи реакций активного деметилирования ДНК, но и участвуют врегуляции работы генома. Прежде всего, это относится к 5hmC – самому стабильному из всехтрёх продуктов окисления 5mC. Для 5hmC характерна специфичная локализация вэнхансерах, участках, фланкирующих промоторы или CpG-островки, и, собственно, в самихгенах.

В CpG-островках 5hmC стабилизирует их неметилированное состояние, а внутри гена,как полагают, может предотвращать инициацию антисмысловой транскрипции (Song, Pfeifer,2016). Таким образом, 5hmC является как маркером процесса активного деметилирования, таки стабильной модификацией цитозина со своими собственными функциями.Степень разработанности темы. Несмотря на то, что 5hmC уже несколько летявляется объектом пристального изучения, многие аспекты, касающиеся его роли вэпигенетическом репрограммировании генома, в клеточной дифференцировке и в реакции навоздействие средовых факторов, остаются не выясненными. Определённая информация наэту тему была получена на модельных объектах (Hajkova et al., 2010; Park et al., 2010;3Wossidlo et al., 2010; Iqbal et al., 2011; Inoue, Zhang, 2011; Zhang et al., 2012; Heras et al., 2014).Работы по изучению особенностей гидроксиметилирования ДНК в гаметогенезе иэмбриогенезе человека остаются малочисленными.

Между тем, не вызывает сомнения, чтокак фундаментальную, так и практическую значимость представляет вопрос о том, когдаустанавливается, как поддерживается и каким образом изменяется в геноме человекараспределение 5hmC на хромосомах человека в проэмбриональный и эмбриональныйпериоды, когда происходит репрограммирование генома и становление эпигенетическихпрофилей, регулирующих дальнейшую реализацию программы развития.Цель исследования – изучить поэтапные изменения характера гидроксиметилированияДНК в гаметогенезе, доимплантационном и постимплантационном эмбриогенезе человека.Задачи:1) колокализовать 5-метилцитозин и 5-гидроксиметилцитозин на метафазных хромосомахразнородительского происхождения на стадии зиготы;2) определить характер гидроксиметилирования ДНК метафазных хромосом в ходе деленийдробления до стадии бластоцисты;3) провести сравнительный анализ гидроксиметилирования ДНК в яйцеклетках,сперматозоидах и зиготах;4) проанализировать характер гидроксиметилирования ДНК в сперматогенных клетках;5) оценить взаимозависимость между характером гидроксиметилирования ДНКсперматозоидов в эякуляте, параметрами спермограммы и долей сперматозоидов сфрагментированной ДНК;6) охарактеризовать тканеспецифические особенности гидроксиметилирования метафазныххромосом в постимплантационном эмбриогенезе человека на 5-12 неделе развития.Научная новизна.

Впервые проведён анализ гидроксиметилирования ДНКметафазных хромосом половых клеток, зигот, бластомеров дробящихся зародышей и клетокэмбриональных и экстраэмбриональных тканей постимплантационных зародышей человека.Установлено, что на стадии зиготы метафазные хромосомы отцовского происхожденияподвергаются активному деметилированию с образованием 5hmC в большей степени, чемметафазные хромосомы материнского происхождения.

Гидроксиметилированная ДНКнеравномерно распределена в метафазных хромосомах зигот: 5hmC преимущественнолокализован в R-, но не G- и C-сегментах. При делениях дробления вплоть до стадиибластоцистыпроисходитпассивнаяпотеря5hmCсобразованиемгемигидроксиметилированныххромосомисохранениемсегментоспецифичногораспределения 5hmC в гидроксиметилированных хроматидах. Получены уникальные данныео межхромосомных, межклеточных и межтканевых различиях гидроксиметилирования ДНКметафазных хромосом эмбрионов человека 5-12 недель развития, обусловленные случайнымсочетаниемгидроксиметилированных,гемигидроксиметилированныхинегидроксиметилированных сестринских хроматид и гомологичных хромосом.