Автореферат (1145830), страница 3
Текст из файла (страница 3)
Таким образом, процессактивного деметилирования имеет определённую видоспецифичность.Анализ распределения иммунофлуоресцентных сигналов 5hmC и 5mC вдоль плечметафазных хромосом проведён на 462 хромосомах из 20 зигот. В хромосомах из наборовотцовского происхождения хроматин, обогащенный 5hmC, локализуется в QFH-негативныхсегментах (R-сегментах) (рис. 3). В хромосомах из наборов материнского происхождения изза слабого общего уровня гидроксиметилирования чётко идентифицировать границы районов,обогащённых 5hmC, не удалось. Однако отмечена тенденция к локализации 5hmC в QFHнегативных сегментах.
В околоцентромерных участках хромосом как отцовского, так иматеринского происхождения, включая большие гетерохроматиновые блоки 1q12, 9q12,16q11.2 и Yq12, 5hmC не обнаружен (рис. 3). Сегментоспецифичная локализация 5hmC можетбыть связана с особенностью R- и G-сегментов, т.к. для них характерен разный нуклеотидныйсостав: R-сегменты обогащены GC-парами, в то время как G-сегменты – АТ-парами(Родионов, 1985; Sumner, 1990). R-сегменты содержат больше генов, чем G-сегменты (Musioet al., 2002). Т.о., активное деметилирование проходит более интенсивно в богатых генами Rсегментах.Рисунок 3.
Совмещённая кариограмма хромосом 1, 9, 16 из наборов отцовского иматеринского происхождения триплоидной зиготы после QFH/AcD-окрашивания ииммунофлуоресцентного окрашивания с помощью антител к 5hmC и 5mC. Стрелкамиуказаны R-сегменты хромосом, обогащенные 5hmC. Синим цветом отмеченыгетерохроматиновые блоки 1q12, 9q12, 16q11.2.При анализе метилирования ДНК в сильно гидроксиметилированных (отцовских)наборах хромосом, наблюдали слабо выраженный дифференциальный рисунок. В слабогидроксиметилированных (материнских) наборах хромосом тенденция к преимущественнойлокализации 5mC в R-сегментах была более выражена.
Все околоцентромерные участки,включая 1q12, 9q12, 16q11.2, были слабо метилированы или совсем не содержали 5mC, независимо от их родительского происхождения (рис. 3). Т.о., 5mC располагался по длинехромосом практически равномерно. Выявленный феномен вызывает удивление, посколькуGC-богатые R-сегменты по сравнению с G-сегментами потенциально несут больше сайтов,которые могут подвергаться метилированию (Wright et al., 2001).
Кроме того, в метафазныххромосомах из лимфоцитов взрослого человека и из клеток эмбриональных тканей,распределение 5mC вдоль плеч хромосом коррелирует с плотностью СрG-динуклеотидов всегментах хромосом (Barbin et al., 1994; Kokalj-Vokac et al., 1998; Баранов и др., 2005;Пендина и др., 2005; Pfarr et al., 2005). Можно предположить, что появлению обнаруженнойнами сегментоспецифичной локализации 5hmC предшествовало сегментоспецифическоеметилирование ДНК на хромосомах. При запуске активного деметилированиярасположенный преимущественно в R-сегментах хромосом 5mC был преобразован в 5hmCферментативными системами, что и привело к гомогенному распределению метилированнойДНК на хромосомах и сегментоспецифичной локализации гидроксиметилированной ДНК.8Таким образом, хромосомы разнородительского происхождения имеют собственныйуникальный характер распределения 5hmC и 5mC.1.2. Распределение 5hmC и 5mC в ДНК метафазных хромосом дробящихся зародышейчеловека и на стадии бластоцистыНачиная со стадии трёх клеток, на метафазных хромосомах эмбрионов человека былоотмечено асимметричное распределение модифицированного цитозина: яркий сигнал 5hmCприсутствовал только на одной хроматиде, а другая хроматида была слабогидроксиметилирована (рис.
4). При этом слабо гидроксиметилированная хроматида быламетилирована в меньше степени, чем другая. В хроматидах с низким содержанием 5hmCнаблюдали сегментоспецифичную локализацию сигнала, не отличающуюся от таковой настадии зиготы. Проанализировано число ассиметрично гидроксиметилированных иметилированных хромосом в полных метафазах и фрагментах метафазных пластинок (n=95)из 61 эмбриона от трёхклеточной стадии до стадии бластоцисты (табл.
1).Рисунок 4. Метафазные хромосомы из бластомеров трёхклеточного зародыша, 5-клеточногозародыша и бластоцисты. QFH/AcD-окрашивание (QFH), иммунофлуоресцентноеокрашивание с помощью антител к 5hmC и к 5mC, совмещённое изображение, и отдельныехромосомы из представленных метафазных пластинок.Таблица 1. Процент асимметрично гидроксиметилированных и метилированных хромосом вяйцеклетках, зиготах и доимплантационных зародышах человека.КоличествоПроцент хромосом сСтадияКоличество метафазных Количество асимметричным сигналомразвитияобразцов пластинок и хромосом5hmC5mCфрагментовЯйцеклетка19194860+0,2%0+0,2%Зигота20206690+0,2%0+0,2%3 клетки4412376,4±3,8%59,2±4,5%4-5 клеток51027540,7±2,9%33,4±2,9%7 клеток-морула151636814,2±2,0%17,3±1,2%Бластоциста376522716,5±0,5%6,6±0,5%9Ранее сходный тип распределения 5mC был описан у ранних эмбрионов мышей иполучил название гемиметилирование (Rougier et al., 1998).
Выявленное в настоящемисследовании уменьшение числа асимметрично гидроксиметилированных и метилированныххромосом в ходе последовательных делений дробления (табл. 1), свидетельствует в пользутого, что у зародышей человека происходят пассивная – зависимая от репликации – потеря5mC и 5hmC (Howlett, Reik, 1991; Inoue, Zhang, 2011). Ранее были получены данные обасимметричном распределении 5hmC на хромосомах доимплантационных зародышей мышей.При делении клетки по одной сестринской хроматиде, обогащённой 5hmC, уходит в каждуюиз дочерних клеток.
Вновь синтезированная ДНК не содержит 5hmC, и таким образом числохромосом, обогащённых 5hmC, уменьшается вдвое после каждого клеточного цикла (Inoue,Zhang, 2011). При дальнейших делениях абсолютное число хроматид, обогащённых 5hmC, неизменяется, и они «рассеиваются» между клеток эмбриона (рис. 5).Рисунок 5. Пассивная потеря 5hmC в ходе делений дробления доимплантационного развитиязародыша человека.На некоторых асимметрично гидроксиметилированных хромосомах зародышей разныхстадий доимплантационного развития 5hmC выявлен не по всей длине хроматиды, а толькона её части. Причиной этого явления могут быть сестринские хроматидные обмены (СХО).СХО – это обмен участками между сестринскими хроматидами одной хромосомы (Haber,1992).
На стадии трёх бластомеров СХО приводили к «арлекиновой» окраске хромосом АТ5hmC — каждая хроматида окрашивалась лишь частично, причём на другой хроматидегомологичный окрашенному участок не нёс сигнала АТ-5hmC. Хроматиды, обогащённые5hmC, при последующих делениях дробления расходятся в разные клетки, и хромосом с«арлекиновой» окраской не наблюдается.Несмотря на то, что для 5mC также характерна зависимая от репликации потеря вовремя делений дробления, к стадии бластоцисты практически не сохраняетсягемиметилированных хромосом. Это связано с реметилированием и приобретениемхромосомами к стадии бластоцисты рисунка сегментоспецифичного распределения 5mC,сходного с таковым в соматических тканях (Pendina et al., 2011).
Это событие совпадает сначалом дифференцировки бластомеров зародыша на внутреннюю клеточную массу (ВКМ) итрофэктодерму (ТЭ). По всей видимости, сохранение на отдельных хроматидах на стадиибластоцисты 5hmC не препятствует началу дифференцировки клеток. Возможно, этихроматиды могут и в дальнейшем сохранять унаследованные из зиготы маркеры активногодеметилирования; при этом с каждым клеточным делением 5hmC всё сильнее «рассеивается»по клеткам. Можно также предположить, что образовавшийся на стадии зиготы 5hmC наопределённом этапе дифференцировки удаляется из хроматина ферментативно.Т.о., деметилирование ДНК у зародышей человека на доимплантационных стадияхразвития происходит за счёт сочетания нескольких механизмов: пассивного деметилированияс удалением 5mC после каждого цикла репликации, активного, с образованием 5hmC настадии зиготы, и последующего его пассивного удаления. Однако, несмотря на зависимую отрепликации потерю 5hmC, он является стабильной эпигенетической модификацией генома10дробящегося зародыша человека, т.к., образовавшись на стадии зиготы, 5hmC сохраняется напротяжении всего доимплантационного развития вплоть до бластоцисты.2.
Гидроксиметилирование и метилирование ДНК половых клеток человека2.1. Распределение 5hmC и 5mC в ДНК мейотических хромосом яйцеклеток человека5hmC и 5mC присутствовали в плечах всех проанализированных хромосом изяйцеклеток, однако, не были выявлены в центромерах и околоцентромерных районах.Распределение 5hmC и 5mC не отличалось в разных яйцеклетках. Наличие 5hmC можетсвидетельствовать о запуске механизма активного деметилирования в геноме яйцеклетки.Однако, предполагают, что у млекопитающих активное деметилирование начинается толькопосле слияния гамет – в зиготе, и затрагивает преимущественно отцовский геном (Iqbal et al.,2011; Wossidlo et al., 2011; Amouroux et al., 2016).
Поэтому наличие в яйцеклеткахгидроксиметилированной ДНК может свидетельствовать о нарушении эпигенетическойреорганизации генома яйцеклетки и быть причиной её неспособности к оплодотворению. Сдругой стороны, гидроксиметилирование ДНК может быть следствием того, что в яйцеклеткеуже запущены процессы, специфичные для стадии зиготы, несмотря на отсутствие мужскогогенома.
Не исключено, что 5hmC может иметь собственные функции в яйцеклетке на данномэтапе развития. Поэтому гидроксиметилирование ДНК яйцеклетки не обязательносвидетельствует о нарушении программы развития.2.2. Распределение 5hmC и 5mC в ДНК сперматозоидов человекаВо всех сперматозоидах выявлен 5mС, а 5hmC присутствовал лишь в единичныхсперматозоидах (рис. 6, А — В). Присутствие в эякуляте доноров лишь небольшого числагидроксиметилированных сперматозоидов вызывает вопрос об их роли: являются ли онианомалией или, напротив, именно они способны к оплодотворению. Для ответа на этотвопрос были исследованы пациенты из бесплодных пар (рис. 6, Г — Е).Рисунок 6.
Сперматозоиды из эякулятов доноров (А — В)и пациентов из бесплодных пар (Г — Е): А, Г —иммунофлуоресцентное окрашивание с помощью антителк 5hmC; Б, Д — иммунофлуоресцентное окрашивание спомощью антител к 5mC; В, Е — фазово-контрастнаямикроскопия.Рисунок 7. Распределениесодержания сперматозоидов с5hmCупациентовснарушением фертильности и удоноров(P<0,0001,Uкритерий Манна-Уитни).Сравнение между группой доноров спермы (n=13) и группой пациентов из бесплодныхпар (n=37) показало следующее: процент сперматозоидов с высоким содержанием 5hmC вгруппе доноров был низким и варьировал в небольшом диапазоне (0,02-0,46%), тогда как у11пациентов из бесплодных пар процент таких сперматозоидов колебался в широких пределах(0,12-21,24%), и был достоверно выше, чем у доноров (Р<0,0001; рис.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
