Автореферат (Хромосомная, клеточная и тканевая специфичность гидроксиметилирования ДНК в проэмбриональный и эмбриональный периоды развития человека), страница 2
Описание файла
Файл "Автореферат" внутри архива находится в папке "Хромосомная, клеточная и тканевая специфичность гидроксиметилирования ДНК в проэмбриональный и эмбриональный периоды развития человека". PDF-файл из архива "Хромосомная, клеточная и тканевая специфичность гидроксиметилирования ДНК в проэмбриональный и эмбриональный периоды развития человека", который расположен в категории "". Всё это находится в предмете "биология" из Аспирантура и докторантура, которые можно найти в файловом архиве СПбГУ. Не смотря на прямую связь этого архива с СПбГУ, его также можно найти и в других разделах. , а ещё этот архив представляет собой кандидатскую диссертацию, поэтому ещё представлен в разделе всех диссертаций на соискание учёной степени кандидата биологических наук.
Просмотр PDF-файла онлайн
Текст 2 страницы из PDF
Впервыеустановлена связь между параметрами спермограммы и характером гидроксиметилированиясперматозоидов в эякуляте: увеличение доли гидроксиметилированных сперматозоидовассоциировано со снижением качества эякулята и нарушениями фертильности.Теоретическая и практическая значимость. Результаты настоящей работы вносятсущественный вклад в понимание механизмов эпигенетической регуляции и организацииработы генома в онтогенезе человека.
Установленные изменения гидроксиметилированияДНК в половых клетках, в доимплантационных и постмиплантационных эмбрионахпозволяют приблизиться к пониманию биологической роли 5hmC в процессахрепрограммирования генома человека в онтогенезе. Полученные результаты могут служитьосновой при разработке и совершенствовании методов оценки функционального состояниягенома. Оценка характера гидроксиметилирования мужских гамет может стать новыминформативным критерием качества эякулята, что будет иметь существенное значение дляповышения эффективности вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ).Методология и методы исследования.
В настоящем исследовании использованкомплексный подход с применением цитогенетических, молекулярно-цитогенетических,4гистологических, иммунофлуоресцентных и статистических методов. Более подробно методыисследования отражены в разделе «Материал и методы».Положения, выносимые на защиту:1. Характер гидроксиметилирования метафазных хромосом зигот является специфичным дляэтой стадии онтогенеза, не наследуется из гамет, а устанавливается de novo и определяетсякак родительским происхождением, так и типом сегмента хромосом.2.
Деметилирование генома доимплантационных эмбрионов человека происходит за счёт какактивного деметилирования с образованием 5-гидроксиметилцитозина на стадии зиготы, таки пассивной потери 5-гидроксиметилцитозина с образованием гемигидроксиметилированныххромосом и пассивной потери 5-метилцитозина с образованием гемиметилированныххромосом при делениях дробления до стадии бластоцисты.3. Гидроксиметилирование метафазных хромосом в постимплантационном развитиичеловекахарактеризуетсявыраженнойгетерогенностьюмежду гомологичнымихромосомами, между хромосомами в пределах метафазной пластинки, между метафазнымипластинками в пределах одной ткани и между тканями эмбриона, обусловленной различнымикомбинациямигидроксиметилированных,гемигидроксиметилированныхинегидроксиметилированных хромосом.4.
Запрограммированное гидроксиметилирование ДНК в сперматогенных клетках человекапроисходит волнообразно на двух стадиях их дифференцировки: в сперматогониях типа Ad исперматидах.5. Гидроксиметилирование ДНК характерно для небольшой доли эякулированныхсперматозоидов. Доля гидроксиметилированных сперматозоидов в эякуляте взаимосвязана состатусом фертильности и параметрами спермограммы, что позволяет рассматривать её какновый критерий качества эякулята.Степень достоверности и апробация результатов. Для интерпретации результатовпривлечено большое количество данных литературы. Сформулированные в работе выводыявляются итогом анализа и обобщения результатов исследования. Полученные в ходе работырезультаты опубликованы в виде 7 научных статей в рецензируемых отечественных изарубежных журналах и 11 тезисных сообщений. Материалы работы были представлены натрёх международных и одной российской конференциях.Личное участие автора в получении результатов.
Личный вклад автора состоит внепосредственном участии в проведении всех этапов работы: в анализе литературы по темеработы, в планировании, организации и проведении экспериментов, оптимизации методик,теоретическом обобщении и статистической обработке результатов, подготовке к публикациистатей и отчётов по теме. Экспериментальная часть работы выполнена в лабораториипренатальной диагностики наследственных и врожденных болезней ФГБНУ «НИИ АГиР им.Д.О.Отта». Материалы, вошедшие в диссертацию, обсуждались и публиковались совместно ссоавторами и научным руководителем.Структура и объём диссертации. Диссертация изложена на 129 страницах и включаетследующие разделы: «Введение», «Обзор литературы», «Материал и методы», «Результаты»,«Обсуждение», «Заключение», «Выводы» и «Список литературы».
Работа иллюстрирована 25рисунками и 4 таблицами. Список литературы содержит 291 источник.МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫМатериалом исследования послужили препараты хромосом и интерфазных ядер,приготовленные из следующего биологического материала:• образцов эякулята от 13 доноров спермы (возраст 22-34 года, средний возраст 28,6±1,1года) и от 37 пациентов из бесплодных пар (возраст 21-53 года, средний возраст 34,9±1,05);• образцов биоптатов тканей семенника 15 пациентов (возраст 24-54 года, средний возраст37,1±2,29 года), имеющих нормальный кариотип, с диагнозом азооспермия (у 7 пациентовпоставлен диагноз обструктивная азооспермия, у 8 – необструктивная азооспермия);• 19 неоплодотворившихся яйцеклеток на стадии MII (метафаза второго деления мейоза),полученных в стандартных циклах ЭКО и не сформировавших пронуклеусы;5• зигот и бластомеров дробящихся зародышей человека до стадии бластоцистывключительно (n=81).
Использованы зиготы, эмбрионы доимплантационных стадий развитияи бластоцисты, полученные в стандартных циклах ЭКО и не пригодные для переноса вполость матки по причине нарушений морфологии или плоидности;• образцов эмбрионального лёгкого и цитотрофобласта хориона 4-х эмбрионов человекасроком развития 5-12 недель: 1 эмбрион на сроке развития 5-6 недель, 2 эмбриона на срокеразвития 8-9 недель, 1 эмбрион на сроке развития 11-12 недель.Методы.Препаратыметафазныххромосомиинтерфазныхядеризнеоплодотворившихся яйцеклеток, зигот и дробящихся зародышей человека былиприготовлены по методике А.П.Дыбана (Dyban et al., 1993) с собственными модификациями(Pendina et al., 2011). Препараты из фрагментов тестикулярной ткани, ворсин хориона ифрагментов эмбриональных органов получали «прямым» методом (без предварительногокультивирования) по описанной ранее методике с собственными модификациями (Кузнецоваи др., 2013).
Иммунофлуоресцентную детекцию 5hmC и 5mC проводили на зафиксированныхуксусно-спиртовым фиксатором (1:3) и QFH/AcD-окрашенных метафазных хромосомах спомощью специфических антител и Cy3/Alexa488/Alexa555-коньюгированных вторыхантител. Для идентификации хромосом применяли АТ-специфичный краситель DAPI.Флуоресцентную гибридизацию in situ (FISH) проводили на препаратах из биоптатовсеменников до иммунофлуоресцентной детекции 5hmC и 5mC с целью определенияплоидности интерфазных ядер, на основании которой можно судить о прохождениисперматогенной клеткой мейотического деления.
FISH проводили в соответствии срекомендациями фирмы производителя ДНК-зондов (Abbott Molecular, США) ссобственными модификациями (Pendina et al., 2017).Анализ препаратов и получение фотоизображений проводили c использованиемфлуоресцентных микроскопов: Leica DM2500, Leica DMLS, ZEISS Axio Imager.A2.Измерение интенсивности флуоресцентного сигнала 5hmC и 5mC на метафазных хромосомахзигот проводили на цифровых фотоизображениях с помощью программы Image J 1.49u.Интенсивность флуоресцентного сигнала измеряли для каждой хромосомы в наборе. Средниезначения флуоресценции сигналов 5hmC и 5mC делили на меньшее из трёх значений длякаждой серии измерений.
При построении графиков распределения иммунофлуоресцентногосигнала вдоль плеч метафазных хромосом зигот для каждой хромосомы выбиралицентральную ось, вдоль которой с помощью инструмента программы ImageJ 1.49u проводилилинию, шириной в один пиксель. По полученным значениям интенсивности флуоресценцииантител строили графики распределения сигнала вдоль хромосомы.Статистическую обработку данных проводили с помощью программ Statistica 8.0 иGraphPad Prism 6.01.
Распределение данных оценивалось по тесту Д'Агостино-Пирсона.Непараметрические данные сравнивались с использованием U-критерия Манна-Уитни.Коэффициенты ранговой корреляции рассчитывали с использованием непараметрическоготеста Спирмена.
Число гидроксиметилированных хромосом в метафазных пластинках изклеток эмбриональных и экстраэмбриональных тканей эмбрионов 5-12 недель развитиясравнивали с использованием непараметрических критериев Крускала-Вэллиса для сравнений4-х выборок и Манна-Уитни для сравнений двух выборок.РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ1. Распределение 5hmC и 5mC в геноме зародышей человека на доимплантационныхстадиях развития1.1. Гидроксиметилирование и метилирование ДНК метафазных хромосомразнородительского происхождения на стадии зиготыПри анализе интенсивности флуоресценции на метафазных хромосомах изтриплоидных зигот были выявлены различия между родительскими наборами: наборыхромосом отцовского происхождения характеризовались более высоким содержанием 5hmCи низким 5mC по сравнению с наборами хромосом материнского происхождения (рис. 1).При сопоставлении средней относительной интенсивности флуоресцентных сигналов АТ5hmC и АТ-5mC выявлены статистически достоверные различия между наборами хромосом6отцовского и материнского происхождения: флуоресценция 5mC была выше в набораххромосом материнского происхождения по сравнению с отцовскими, а флуоресценция 5hmCбыла выше в наборах хромосом отцовского происхождения по сравнению с материнскими(P<0,0001; рис.
2).Рисунок 1.Метафазные хромосомытриплоидной зиготы. А —иммунофлуоресцентноеокрашивание с помощью антителк 5hmC. Б —иммунофлуоресцентноеокрашивание с помощью антителк 5mC. В — совмещенноеизображение. Г — QFH/AcDокрашивание. Обозначены наборыхромосом отцовского (♂) иматеринского (♀) происхожденияи половые хромосомы.Рисунок 2. Относительнаяинтенсивностьфлуоресценции 5mC и5hmCвметафазныххромосомахразнородительскогопроисхождениявтриплоидныхзиготах(*,**P<0,0001, U-критерийМанна-Уитни для малыхвыборок).Ранее был выявлен высокий уровень содержания 5hmC в мужских пронуклеусах узигот мышей, коров и кроликов, что свидетельствует в пользу ТЕТ-опосредованногодеметилирования (Iqbal et al., 2011; Wossidlo et al., 2011; Zhang et al., 2012; Amouroux et al.,2016). Выявленный в настоящем исследовании высокий уровень гидроксиметилированияхромосом отцовского происхождения свидетельствует о том, что в зиготах человекапроисходит аналогичный процесс с образованием 5hmC.
По-видимому, у млекопитающихэтот механизм является универсальным и эволюционно консервативным. 5hmC такжевыявлен в хромосомах материнского происхождения, но степень обогащённости хроматина5hmC в них значительно ниже, чем в хромосомах отцовского происхождения. Данные обуровне метилирования ДНК в геноме зигот модельных объектов свидетельствуют в пользутого, что женский геном не подвергается активному деметилированию (Iqbаl et al., 2011;Wоssidlо еt аl., 2011; Zhаng et al., 2012). Однако, результаты, полученные в настоящемисследовании, доказывают, что у человека на стадии зиготы процесс активного7деметилирования характерен для обоих пронуклеусов, но в хромосомах отцовскогопроисхождения проходит более интенсивно, чем в материнских.