Автореферат (Хромосомная, клеточная и тканевая специфичность гидроксиметилирования ДНК в проэмбриональный и эмбриональный периоды развития человека), страница 4
Описание файла
Файл "Автореферат" внутри архива находится в папке "Хромосомная, клеточная и тканевая специфичность гидроксиметилирования ДНК в проэмбриональный и эмбриональный периоды развития человека". PDF-файл из архива "Хромосомная, клеточная и тканевая специфичность гидроксиметилирования ДНК в проэмбриональный и эмбриональный периоды развития человека", который расположен в категории "". Всё это находится в предмете "биология" из Аспирантура и докторантура, которые можно найти в файловом архиве СПбГУ. Не смотря на прямую связь этого архива с СПбГУ, его также можно найти и в других разделах. , а ещё этот архив представляет собой кандидатскую диссертацию, поэтому ещё представлен в разделе всех диссертаций на соискание учёной степени кандидата биологических наук.
Просмотр PDF-файла онлайн
Текст 4 страницы из PDF
7). Размах варьированиядоли гидроксиметилированных сперматозоидов у пациентов в 48 раз превышает таковой удоноров спермы. Картина распределения 5mC в сперматозоидах пациентов была идентичнатаковой в сперматозоидах доноров: 5mС выявлен во всех проанализированныхсперматозоидах (рис. 6). Интенсивность флуоресценции 5mC была выше в 5hmCположительных сперматозоидах (P<0,0001). По всей видимости, увеличение уровня 5hmC вотдельных сперматозоидах является скорее вариантом патологии, чем нормой.2.3. Сопоставление содержания в экуляте сперматозоидов с 5hmC с параметрамиспермограммы и с долей сперматозоидов с фрагментацией ДHКС учётом сильного варьирования доли сперматозоидов с 5hmC в эякуляте доноров и,особенно, пациентов из бесплодных пар, актуальным представлялось сопоставить этотпараметр с различными показателями спермограммы.
Оценку взаимосвязи проводили спомощью вычисления коэффициента корреляции по Спирмену. Обнаружена сильнаяотрицательная корреляция с частотой морфологически нормальных сперматозоидов (r=-0,567,P<0,0001) и сперматозоидов с нормальной головкой (r=-0,609, P<0,0001). Также былаобнаружена слабая положительная корреляция между долей сперматозоидов с 5hmC и долейнепрогрессивно-подвижных сперматозоидов (r=0,346, P=0,014) и подвижных сперматозоидов(r=0,317, P=0,025). Корреляции между долей 5hmC-положительных сперматозоидов иконцентрацией сперматозоидов (r=0,077, P=0,595), долей прогрессивно-подвижныхсперматозоидов (r=-0,192, P=0,183), долей сперматозоидов с аномальным хвостом (r=0,142,P=0,327) и долей сперматозоидов с аномальной шейкой (r=-0,157, P=0,276) не обнаружили.Такжепроанализироваливзаимосвязьмеждусодержаниемвэякулятегидроксиметилированных сперматозоидов и сперматозоидов с фрагментированной ДНК.Фрагментацию ДHК оценивали методом TUNEL (Теrminal deoxynucleotidyl transferasemediated dUТР Niсk-Еnd Labelling), выявляющим одно- и двунитевые разрывы в ДНК.
Былавыявлена сильная положительная корреляция содержания в эякуляте 5hmC-положительныхсперматозоидов с частотой TUNEL-положительных сперматозоидов (r=0,46, P=0,001). Такимобразом, наблюдается сильная отрицательная корреляция с показателями хорошего качестваспермы, и сильная положительная корреляция с показателем плохого качества спермы —частотой TUNEL-положительных сперматозоидов. Впервые показано, что высокая долясперматозоидов с 5hmC в эякуляте является негативным прогностическим критериемфертильности, т.е.
выявление 5hmC в сперматозоидах может рассматриваться как один изновых возможных тестов для оценки качества эякулята.Вероятно, процесс окисления 5mC с образованием 5hmC вызывается активнымиформами кислорода (АФК), возникающими в результате оксидативного стресса. ИзбытокАФК может быть вызван как внутренними, так и внешними факторами.
Образование АФКпри окислительном стрессе связано с появлением в ДНК 5hmC. Также избыточноесодержание АФК является основным механизмом, ответственным за повреждение ДНКсперматозоидов (Lopes et al., 1998). Таким образом, АФК могут индуцировать оба процесса:превращение 5mC в 5hmC и повреждение ДНК. Появление в эякуляте отдельныхсперматозоидов, содержащих 5hmC, происходит, вероятно, в результате спонтанноговоздействия на них АФК в придатке яичка (эпидидимисе) именно в тот периодспермиогенеза, когда геном гаметы наиболее уязвим в связи с отсутствием практически всейцитоплазмы.2.4. Становление рисунка гидроксиметилирования и метилирования ДНК всперматогенных клетках человекаВ клетках тестикулярной ткани человека 5mC обнаружен во всех типах клетоксперматогенного ряда, в том числе на хромосомах митотически делящихся сперматогониев имейотически делящихся сперматоцитов. В отличие от 5mC, 5hmC не характерен дляхромосом делящихся сперматогенных клеток человека и выявлен лишь в отдельных12интерфазных ядрах клеток из биоптатов семенников (рис.
8). Все сперматозоиды избиоптатов семенников (n=1455) были метилированы, но не содержали 5hmC.Рисунок 8. Интерфазные ядра и хромосомы из сперматогенных клеток после QFH/AcDокрашивания и иммунофлуоресцентного окрашивания с помощью антител к 5mC, 5hmC исовмещённое изображение. А — сперматогоний на стадии метафазы митоза, Б —сперматоцит на стадии пахитены, В — сперматоцит на стадии диплотены, Г — сперматоцитна стадии метафазы второго деления мейоза.Для установления плоидности ядер, содержащих 5hmC, использовали комбинациюметодов иммунофлуоресценой детекции 5hmC и 5mC и флуоресцентной гибридизации in situ(FISH).
Было выявлено 4 типа интерфазных ядер, отличающихся по плоидности ихарактеру окрашивания антителами к 5hmC: диплоидные окрашенные, диплоидныенеокрашенные, гаплоидные окрашенные, гаплоидные неокрашенные. На цитогенетическихпрепаратах сперматогенных клеток каждого из 15 пациентов была установлена доля ядеркаждого типа среди проанализированных 5000 ядер. Содержание диплоидных ядер с 5hmCварьировало в пределах от 32,62 до 52,57% (в среднем 40,75±5,89). В тканях семенникачеловека диплоидные клетки представлены, в основном, сперматогониями. Средидиплоидных ядер, содержащих 5hmC, преобладали ядра с большой центральной вакуолью,которая является характерным морфологическим признаком сперматогониев типа Ad, но несперматогониев типа Ар или B (Clermont, 1966).
Диплоидные ядра без вакуоли могутпринадлежать либо соматическим клеткам, либо сперматогониям Ар или B. Диплоидныегидроксиметилированные ядра без вакуоли составили не более 1-2%.Содержание гаплоидных ядер с 5hmC составило 0,42-1,96% (в среднем 1,18±0,51) (рис.9) — это ядра сперматид, прошедших мейотическое деление. Соотношения разных типовядер (диплоидных с 5hmC, диплоидных без 5hmC, гаплоидных с 5hmC, гаплоидных без5hmC) не различались между разными пациентами, в том числе не было выявлено различиймежду пациентами с обструктивной и необструктивной азооспермией (P=0,978, z-критерийФишера) (рис.
9). Клетки на разных стадиях сперматогенеза были одинаково представлены увсех индивидов, и наблюдаемая картина распределения 5hmC, вероятнее всего, определяетсяпрограммой сперматогенеза, а не является результатом случайных воздействий, которыемогли бы привести к межиндивидуальной вариабельности.Для подтверждения данных, полученных при иммунофлуоресцентной детекции 5hmCи 5mC, была проведена иммуногистохимическая детекция на срезах тестикулярной ткани.135mC присутствовал во всех типах клеток в семенных канальцах, а 5hmC — лишь в некоторыхклетках (рис.
10). Гидроксиметилированные клетки, в основном, были расположены вблизибазальной мембраны и имели вакуоли, что подтверждает заключение о том, что этосперматогонии типа Ad.Рисунок 9. Соотношение различныхтиповядервкаждомизпроанализированныхобразцовбиоптатовсеменника(n=15).Соотношения не отличаются междупациентами с обструктивной инеобструктивнойазооспермией(P=0,978, z-критерий Фишера).Рисунок 10.
Иммуногистохимическая детекция 5mC и 5hmC на срезе семенных канальцев.Т.о., 5mC обнаружен во всех типах сперматогенных клеток, а 5hmC содержится в40,75±5,89% ядер сперматогониев и в 1,18±0,51% ядер сперматид, и отсутствует в делящихсямитозом сперматогониях, делящихся мейозом сперматоцитах, а также в сперматозоидах.Известно, что у мышей в сперматогенных клетках содержание 5hmC также варьирует:самый высокий уровень обнаружен в сперматогониях, а в сперматидах он ниже более чем в 3раза.
Это может быть связано с экспрессией генов семейства TET: они экспрессируются вдиплоидных сперматогенных клетках активнее, чем в гаплоидных (Gan et al., 2013). Этосогласуется с исследованием, проведённым на гистологических срезах семенника человека, вкотором показан высокий уровень 5hmC в сперматогониях Ad (Nettersheim et al., 2013). Ранеепредполагали, что в ходе деления сперматогенных клеток происходит пассивная потеря5hmC, т.е. его уровень снижается с каждым делением клетки (Nettersheim et al., 2013; Ni et al.,2016).
Однако, в настоящей работе среди всех митотических и мейотических хромосом необнаружено маркеров зависимой от репликации потери 5hmC — ассиметричногидроксиметилированных хромосом. Другим типом клеток, в которых присутствует 5hmC,были сперматиды. Таким образом, процесс активного деметилирования, сопровождающийэпигенетическое репрограммирование половых клеток происходит ещё до начала ихдифференцировки в сперматоциты и продолжается и в сперматидах.Характер распределения 5hmC не отличается у всех пациентов с нарушениемфертильности. Это указывает, во-первых, на волнообразное течение активного14деметилирования, которое проходит в два этапа: перед вступлением сперматогониев в мейози после его завершения на стадии сперматид, а, во-вторых, — на универсальность изапрограммированность этого процесса в сперматогенезе человека.Таким образом, специфические рисунки гидроксиметилирования и метилирования вродительских гаметах отличаются от таковых в материнских и отцовских наборах хромосомзиготы.
Это свидетельствует в пользу того, что формирование паттернагидроксиметилирования и метилирования в геноме зиготы происходит de novo. В зиготе этотпроцесс начинается сразу после оплодотворения и строго запрограммирован. В то же время,изменения специфичности распределения 5hmC в сперматогенезе человека как строгозапрограммированы в ходе дифференцировки, так и могут быть индуцированы внешнимии/или внутренними факторами на завершающих стадиях спермиогенеза.3. Анализ гидроксиметилирования и метилирования ДНК метафазных хромосом уэмбрионов человека 5-12 недель развитияРаспределение метилированной ДНК на метафазных хромосомах из клетокцитотрофобласта хориона и эмбрионального лёгкого характеризовалось сегментнойспецифичностью: 5mC преимущественно локализован в R-сегментах и гетерохроматиновыхблоках хромосом 1, 9, 16 и Y.
Такой тип распределения 5mC характерен для всех хромосом навсех проанализированных метафазных пластинках, что согласуется с данными, полученнымиранее (Баранов и др., 2005; Ефимова, 2012). Распределение 5hmC анализировали нахромосомах, окрашенных DAPI после иммунофлуоресцентной детекции модифицированногоцитозина, т.е. после этапа денатурации ДНК. В связи с этим проведение детальногосегментного анализа локализации гидроксиметилированной ДНК было невозможным.Установлена тенденция к преимущественной локализации гидроксиметилированной ДНК вDAPI-негативных сегментах метафазных хромосом (R-сегментах). В гетерохроматиновыхблоках хромосом 1, 9, 16, Y, а также в центромерных участках хромосом 5hmC отсутствовал.При анализе распределения гидроксиметилированной ДНК выявлено, что в пределахкаждой метафазной пластинки только некоторые хромосомы содержали 5hmC.
Число такиххромосом варьировало на разных метафазных пластинках, как из клеток эмбриональноголёгкого, так и из клеток цитотрофобласта хориона. При этом не наблюдали специфичностилокализации 5hmC в каких-либо определённых хромосомах (рис. 11).Рисунок 11. Метафазные хромосомы из некультивированных клеток эмбрионального лёгкогочеловека и цитотрофобласта хориона после окрашивания с помощью антител к 5mC, 5hmC иокрашивания DAPI.Проанализировали– из цитотрофобластаметафазную пластинкуэмбрионального лёгкого104 метафазных пластинки из клеток эмбрионального лёгкого и 81хориона.
Число гидроксиметилированных хромосом на однуварьировало от 4 до 45 (в среднем 38,5±1,00) в клеткахи было достоверно выше, чем в цитотрофобласте хориона15(непараметрический критерий Крускала-Вэллиса, p<0,0001), где оно составляло 0-44 (всреднем 25,6±1,60). На некоторых гидроксиметилированных хромосомах 5hmC былраспределён асимметирично: 5hmC локализовался в одной сестринской хроматиде, в то времякак другая была негидроксиметилирована. Число гемигидроксиметилированных хромосом наодну метафазную пластинку в эмбриональном лёгком варьировало от 0 до 34 (в среднем12,2±0,59) и было значительно выше, чем в цитотрофобласте хориона (р<0,0001), где оносоставляло 0-25 (в среднем 8,6±0,63). Между разными эмбрионами статистически значимыхразличий по содержанию асимметрично гидроксиметилированных хромосом в метафазныхпластинках из клеток лёгкого и цитотрофобласта хориона не выявлено.При анализе распределения 5hmC установлены разные типы локализации сигнала впарах гомологичных хромосом.