Диссертация (Молекулярно-генетические аспекты развития гестоза у женщин северо-западного региона Hоссии), страница 2

МикроРНК представляют собой малые некодирующиеРНК длиной 19-24 нуклеотидов, основной функцией которых является постранскрипционноеподавление экспрессии генов. Показано, что микроРНК регулируют синтез более 30% геновчеловека и участвуют во всех биологических процессах, как в норме, так и при патологии [Chenand Wang, 2013; Zhao et al., 2013]. Существуют данные, что микроРНК играют важную роль прибеременности [Chen and Wang, 2013; Zhao et al., 2013].

По оценкам разных авторов в тканяхплаценты синтезируется более 300-600 типов микроРНК, дисрегуляция некоторых из нихобнаружена при различных осложнениях беременности, в том числе и при гестозе [Chen andWang, 2013; Zhao et al., 2013]. Активно проводятся исследования по изучению содержаниямикроРНК в плаценте при гестозе. С 2012 стали использовать технологию полногеномногосеквенирования [Ishibashi et al., 2012;Weedon-Fekjær et al., 2014]. Однако все подобные работывыполнены за рубежом [Ishibashi et al., 2012;Weedon-Fekjær et al., 2014], в то время как в Россиитаких исследований не проводили.Цель и задачи.

Изучить ассоциацию вариантов полиморфных сайтов генов,контролирующих различные метаболические и функциональные системы (свертывание крови,артериальное давление, функции эндотелия и метаболизм липидов), а также изменений всодержании плацентарных микроРНК с развитием гестоза.Для достижения цели были поставлены следующие задачи:1. Провести сравнительный анализ частот вариантов полиморфных сайтов 7-и генов системысвертывания крови (F7 rs6046, F5 rs6025, F2 rs1799963, FGB rs1800790, ITGB3 rs5918, ITGA2rs1126643, PAI1 rs1799768), 6-и генов регуляции артериального давления (REN rs2368564, AGTrs699, AGTR1 rs5186, AGTR2 rs11091046, BKR2 rs1799722, ADRB2 rs1042713 и rs1042714), 2-хгенов дисфункции эндотелия (NOS3 rs1800779, MTHFR rs1801133) и 5-и генов метаболизма6липидов (LPL rs328, APOA1 rs4938303, SCARB1 rs5888, NR1H2 rs2695121 и CETP rs3764261) уженщин с гестозом и в группе сравнения.2.

Определить частоты вариантов этих полиморфных сайтов в зависимости от клиническихформ гестоза.3. Оценить влияние сочетаний вариантов изученных полиморфных сайтов на риск развитиягестоза и его клинических форм.4. Исследовать ассоциацию изученных изменений нуклеотидной последовательности cклинико-лабораторными показателями у женщин с гестозом.5. С помощью технологии полногеномного секвенирования провести сравнительный анализсодержания микроРНК в плацентах с гестозом и в плацентах женщин без осложненийбеременности.Научная новизна.

В рамках данного исследования впервые у женщин СевероЗападного региона России проведен анализ ассоциации вариантов полиморфных сайтовгенов F7 rs6046, F5 rs6025, F2 rs1799963, FGB rs1800790, ITGB3 rs5918, ITGA2 rs1126643,REN rs2368564, AGT rs699, AGTR1 rs5186, AGTR2 rs11091046, BKR2 rs1799722, ADRB2rs1042713 и rs1042714, NOS3 rs1800779, MTHFR rs1801133, LPL rs328, APOA1 rs4938303,SCARB1 rs5888, NR1H2 rs2695121 и CETP rs3764261 с гестозом в целом, в зависимости оттяжести, срока манифестации патологии и наличия фоновых заболеваний. Впервые выявленаассоциация между риском развития гестоза и генотипом AA rs6046 гена F7. Впервыеполучены данные, свидетельствующие о роли сочетаний аллелей генов PAI1, AGT, AGTR2 иADRB2 в развитии предрасположенности к гестозу. Впервые показано, что у гомозигот TTrs1126643 гена ITGA2 повышен риск развития тяжелых форм гестоза (артериальное давлениеболее 160/110 мм.рт.ст.), у гомозигот AA rs4938303 гена APOA1 - риск раннего гестоза (до34 недели беременности), у гомозигот TT и носителей аллели T rs5888 гена SCARB1 - рискгестоза на фоне ожирения.

Установлено, что у гомозигот CC повышен, а у гетерозигот СTrs1126643 гена ITGA2 снижен риск гестоза на фоне сахарного диабета. Впервые показано,что определенные варианты полиморфных сайтов генов AGTR2, MTHFR, LPL и NR1H2ассоциированы с гестозом на фоне различных заболеваний. Выявлены сочетания генотиповпо исследуемым полиморфным сайтам, ассоциированные с риском развития гестоза приналичии фоновых заболеваний.

Установлена ассоциация между изученными вариантамигенов FGB, ITGB3, REN, AGT, AGTR1, AGTR2, BKR2, ADRB2, NOS3, PAI1, NR1H2, SCARB1, LPL иклинико-лабораторными показателями у беременных с гестозом.Впервые в России с помощью технологии полногеномного секвенированияпроведено исследование содержания микроРНК в плаценте при гестозе. Впервые получены7результаты, свидетельствующие о повышении уровня miR-518a, miR-527, miR-518f, miR4532 и снижении - miR-135b в плаценте при гестозе.Теоретическая и практическая значимость.

Результаты настоящего исследованиявносят вклад в представление о молекулярно-генетических механизмах развития гестоза.Полученные данные могут служить основой для дальнейших исследований по идентификациигенетических факторов риска развития гестоза, поиска диагностических маркеров этогоосложнения беременности, создания тест-систем для выявления женщин с повышенным рискомвозникновениягестозаиразработкипатогенетическиобоснованныхлечебно-профилактических мероприятий. Результаты работы могут быть использованы в учебнометодическом процессе на биологических и медицинских факультетах вузов.Методология и методы исследования. Диссертационное исследование основано насовременных представлениях об этиологии и патогенезе гестоза и проведено в соответствии смировым опытом научно-исследовательских работ в области молекулярной генетики.Методами молекулярного типирования исследован 21 полиморфный сайт 20 геновкандидатов гестоза у пациенток с этим осложнением беременности и у женщин группысравнения.

Далее с помощью ассоциативного метода изучена связь вариантов исследованныхполиморфных сайтов с развитием гестоза. На первом этапе проведен анализ ассоциации этихвариантов с риском гестоза и его отдельных клинических форм. Выполнено 13 вариантовсравнения частот аллелей и генотипов по всем исследуемым сайтам между разными группамибольных и группой сравнения. На втором этапе проведен анализ совместного влиянияисследуемых изменений на риск развития гестоза в целом и его отдельных клинических форм вчастности. На заключительном этапе изучена связь всех исследуемых изменений нуклеотиднойпоследовательности с вариабельностью 44-х клинико-лабораторных показателей при гестозе.С целью анализа содержания микроРНК при гестозе проведено секвенирование кДНКкопий малых РНК, выделенных из 11 образцов плацентарной ткани от пациенток с гестозом иженщин без осложнений беременности.

Далее выполнен сравнительный анализ полученныхданных с помощью методов биоинформатики.Более подробно молекулярно-генетические, статистические и биоинформационныеметоды исследования отражены в разделе «Материалы и методы».Положения, выносимые на защиту:1. Варианты полиморфных сайтов генов системы свертывания крови, регуляцииартериального давления (АД), функционирования эндотелия и метаболизма липидов,ассоциированы с развитием гестоза у женщин, проживающих в Северо-Западном регионеРоссии.82. Определенные варианты исследуемых полиморфных сайтов и их сочетаний влияют нариск развития гестоза.3.

Существуют различия в ассоциации вариантов исследуемых полиморфных сайтов иих сочетаний с риском гестоза в зависимости от клинических особенностей и фоновыхзаболеваний.4. Исследуемые вариации ДНК ассоциированы с клиническими и биохимическимипоказателями у беременных с гестозом.5. Плаценты от женщин с гестозом и без осложнений беременности отличаются посодержанию микроРНК.Степень достоверности и апробация результатов. Исследование выполняли сиспользованием современных молекулярно-генетических методов, включая "Кардио-биочип" и"Фибр-биочип" ("Биочип-ИМБ", Москва) с высокой специфичностью (точностью) анализа.

Для"Кардио-биочипа" она составляет 99,0% [Глотов, 2005], для "Фибр-биочипа" - 99,8%. В ходеанализа полиморфизма длин рестрикционных фрагментов, использовали контрольные образцыДНК, результаты генотипирования для которых были подтверждены секвенированием.Изучение профиля экспрессии микроРНК проводили с помощью технологии ионногополупроводникового секвенирования на приборе Ion Torrent PGM ("Thermo Fisher ScientificInc.", США). Точность анализа составляет 99,5%. На всех этапах эксперимента (подготовкаобразцов к секвенированию) проводили контроль качества согласно инструкциям фирмыпроизводителя.Образцы,неотвечающиетребованиямпротоколов,исключалисьизисследования. Основные выводы работы обоснованы и полностью соответствуют полученнымрезультатам.

Достоверность выводов подтверждается корректной статистической обработкойданных.Результаты данного исследования представлены на XX-ом Международном конгрессе погенетике (Berlin, 2008), на Европейских конгрессах по генетике человека (Barcelona, 2008;Amsterdam, 2011), на VI-ом съезде Вавиловского общества генетиков и селекционеров (ВОГиС)(Ростов-на-Дону, 2014), на VI Съезде российских медицинских генетиков (Ростов-на-Дону,2010), на 1-ом международном семинаре для молодых учёных Балтийского региона (Tartu,2010), на II-ой Всероссийской научно-практической конференции «Медико-биологическиеаспекты мультифакториальной патологии» (Курск, 2011), на V Всероссийской конференции«Пренатальная диагностика и генетический паспорт – основа профилактической медицины ввекнанотехнологий»(Санкт-Петербург,2012),нанаучныхсеминарахлабораториипренатальной диагностики наследственных и врожденных болезней человека ФГБНУ “НИИакушерства, гинекологии и репродуктологии им.